畢業(yè)論文-紅霉素產(chǎn)生菌的篩選與鑒定

1、本科畢業(yè)論文紅霉素產(chǎn)生菌的篩選與鑒定study on erythromycin bacteria screening andevaluation學(xué)院名稱：生物與食品工程學(xué)院 專業(yè)班級(jí)：牛.物技術(shù)2011級(jí)1班 學(xué)生姓名：學(xué)號(hào)：指導(dǎo)教師姓名：指導(dǎo)教師職稱：講師2015年5月目錄摘要ivabstractn引言1第一章緒論21.1總體研究現(xiàn)狀21.2生產(chǎn)工藝優(yōu)化研究現(xiàn)狀21.3紅霉索簡(jiǎn)介31.4紅霉素的特點(diǎn)41.5紅霉素的性狀41.6紅霉素的藥理作用4第二章材料與方法52材料與儀器52.1.1試驗(yàn)材米斗52.1.2試驗(yàn)試劑52.1.3試驗(yàn)儀器52.2試驗(yàn)方法62.2.1發(fā)酵液的預(yù)處理和過(guò)濾62.2.

2、2紅霉素的捉取62.2.3發(fā)酵方法6第三章試驗(yàn)結(jié)果83.1選因素、定水平83.2實(shí)驗(yàn)方案及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果93.3菌種的初篩與馴化123.4紅霉素產(chǎn)生菌的篩選和鑒定123.5菌株的生物學(xué)特性及鑒定133.5.1菌株的形態(tài)特征133.5.2菌株的生理生化特征133.6菌種鑒定16第四章討論18結(jié)論19參考文獻(xiàn)20致謝22紅霉素菌種的篩選及鑒定摘要：紅霉素erythromycin, er）別名愛(ài)紅丿隸，是大家都非常熟悉的一種大環(huán)內(nèi)酯類堿性 抗生素，具冇廣譜抗菌活性，紅霉素的抗菌譜和青霉素g相似，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具冇抗菌 活性。紅霉素是臨床上常用的抗生素z,其游離堿供口服用，乳酸糖鹽供注射用。有耐 藥性金黃

3、色葡萄球菌感染和溶血性鏈球菌感染所引致的疾病的首選紅霉索藥物，它也可用 于青霉素過(guò)敏患者。由于紅霉素的這種很普遍的用途，所以提高發(fā)酵液屮紅霉素產(chǎn)量顯的 至關(guān)重要。要想獲得高質(zhì)量高產(chǎn)量的紅霉素就必須對(duì)菌種進(jìn)行篩選和鑒定。所以本課題運(yùn) 用發(fā)酵方法研究紅霉素菌種的篩選及鑒定，從篩選的方法和過(guò)程上進(jìn)行詳細(xì)的論述和解 釋，最后通過(guò)鑒定選擇出了克雷伯氏菌屬、氨基酸球菌屬和變形菌屬這幾種優(yōu)秀菌種。關(guān)鍵詞：紅霉素；抗生素；發(fā)酵；糖多砲菌；鏈霉菌hierythromycin strain screening and identificationabstract： erythromycin is all very

4、 familiar with an antibiotic, is found that the erythromycin streptomyces fermentation product broad-spectrum antibacterial activity of large ring lactone class antibiotic, antibacterial spectrum and its similar to penicillin g, have antibacterial activity for gram-positive bacteria erythromycin is

5、one of the commonly used antibiotics, clinical treatment is resistant staphylococcus aureus infection and drug of choice for hemolytic streptococcus infection caused disease, and can be used for penicillin allergy sufferers so it is very important to increase production of erythromycin in the fermen

6、ted liquid change so this topic with erythromycin fermentation method research the screening and identification of species, from the screening method and the process to explain in detail, finally selected through the identification of klebsiella genera coccus of amino acids and deformation of the se

7、veral kinds of excellent strainskey words: erythromycin antibiotics ferment saccharopolysporastreptomycete引言紅霉素erythromycin, er）的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用已有很長(zhǎng)吋間的歷史。雖然現(xiàn)今抗菌藥物越 來(lái)越多，但紅霉素在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域仍然有很重要的地位。對(duì)青霉素過(guò)敏、具有耐藥菌感染的患 者可以使用紅霉素，它也對(duì)支原體、軍團(tuán)菌和厭氧球菌感染等有效，所以它的適應(yīng)癥述在 擴(kuò)大。紅霉索是從紅色鏈霉菌培養(yǎng)液中分離岀來(lái)的一種大環(huán)內(nèi)酯類堿性抗生索，具有廣譜抗 菌活性。正是由于紅霉素的這種廣泛而必不可少的用途，

8、我國(guó)一直在不斷地開(kāi)發(fā)該領(lǐng)域的 應(yīng)用價(jià)值。經(jīng)過(guò)多年的不斷努力，我國(guó)成為全球第一大紅霉素原料約生產(chǎn)國(guó)，而紅霉素的 應(yīng)用也逐漸國(guó)際化，我國(guó)的這種原料優(yōu)勢(shì)使我國(guó)自然成為歐美和東南亞地區(qū)紅霉素原料藥 的主要供應(yīng)國(guó)。這也給中國(guó)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出了不小的貢獻(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)研究紅霉索產(chǎn)生菌的篩選及鑒定，提高紅霉索的質(zhì)量和產(chǎn)量，使它能更好的用 于抗生素類藥物研究。同時(shí)也可以增強(qiáng)社會(huì)認(rèn)知度，擴(kuò)大市場(chǎng)需求，使紅霉素的影響更廣 泛，為人們更好的認(rèn)識(shí)了解紅霉素打下基礎(chǔ)。第一章緒論紅霉素(erythromycin, er)是紅色糖多孑包菌(saccharopolysporaerythraea)的次級(jí)代 謝產(chǎn)物，是一種十四元大環(huán)內(nèi)酯

9、類堿性抗生索。它的抗菌譜和青霉索g相似，特別對(duì)抗酸 桿菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、病毒及立克次氏體有抗菌活性，如果某些疾病是由耐藥性金黃色 葡萄球菌和溶血性鏈球菌感染引起的，那么紅霉素應(yīng)該是首先要考慮使用的，它是這方面 疾病的首選藥物。在醫(yī)學(xué)發(fā)展的過(guò)程屮，紅霉素衍生物的興起使母體紅霉素的需求大大增 加。紅霉素的產(chǎn)生主要通過(guò)發(fā)酵，而我國(guó)紅霉素發(fā)酵水平都比較低而且是重復(fù)操作，與發(fā) 達(dá)國(guó)家相比差距還比較人。當(dāng)國(guó)外發(fā)酵單位已達(dá)8000u/ml 12000u/ml的時(shí)候，我國(guó)還 處于研究開(kāi)發(fā)階段。由于這些原因造成我國(guó)生產(chǎn)紅霉素的利潤(rùn)很低。為此我國(guó)學(xué)者為提高 紅霉素發(fā)酵水平在紅霉素發(fā)酵、提取工藝優(yōu)化、菌種篩選鑒定

10、方面作了較多研究工作。 11總體研究現(xiàn)狀在人類與致病微生物的斗爭(zhēng)歷史上，以抗生素為代表的微生物藥物起到了至關(guān)重要的 作用。阿奇霉素、羅紅霉素、克拉霉素等都是紅霉素的半合成品，它們的岀現(xiàn)以及紅霉素 應(yīng)用領(lǐng)域的擴(kuò)大都快速拉動(dòng)了紅霉素原料藥的生產(chǎn)需求。因?yàn)榧t霉素是一種廣譜抗生素藥 物，在臨床上應(yīng)用廣泛，所以以提高其產(chǎn)生菌種發(fā)酵單位為目的的遺傳育種工作一直未曾 停止。曲于我們對(duì)微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成機(jī)制了解的不是太全面，常規(guī)的誘變選 育的方法存在很多缺點(diǎn)如：周期長(zhǎng)、效率低和隨機(jī)性大。所以近年來(lái)我們?cè)诩t霉素高產(chǎn)菌 株的篩選方面收效不大。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)際上對(duì)紅霉素產(chǎn)生菌種的基因工 程改

11、造進(jìn)行了諸多嘗試，然而研究者并不是對(duì)紅霉素生物合成的次生代謝途徑做特異性的 遺傳修飾，而是著力于與產(chǎn)生紅霉素相關(guān)的底物供應(yīng)或者是限制紅霉素產(chǎn)生的因素上。因 此，當(dāng)紅霉索生產(chǎn)中面臨的冇效組分偏低等這些問(wèn)題時(shí)，我們?nèi)狈有У尼槍?duì)性的解決辦 法。1. 2生產(chǎn)工藝優(yōu)化研究現(xiàn)狀發(fā)酵是紅霉索生產(chǎn)過(guò)程的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，具有操作經(jīng)驗(yàn)的操作者通過(guò)生產(chǎn)過(guò)程中的信 息和自己的經(jīng)驗(yàn)知識(shí)，需要隨吋補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)物料，調(diào)整基質(zhì)，使微生物沿著理想的生長(zhǎng)代謝 方式進(jìn)行。在發(fā)酵過(guò)程中，盡管對(duì)環(huán)境的參數(shù)，如發(fā)酵溫度、ph值、溶解氧濃度(do)、 接種量等都可以控制得很好，但是由于微生物生長(zhǎng)過(guò)程是微觀的、不能隨吋掌握，發(fā)酵過(guò) 程屮的關(guān)鍵變

12、量如總糖濃度、菌絲濃度不可在線測(cè)量，使得發(fā)酵過(guò)程的控制問(wèn)題變得很復(fù) 雜3。現(xiàn)在人們都懂得一個(gè)道理：是藥三分毒，任何約物或許都存在一定的副作用。歐洲 藥典規(guī)定在紅霉素產(chǎn)品屮erb的含量不能超過(guò)5%。因此，捉高紅霉素發(fā)酵液屮era的含量 和純度，降低副產(chǎn)物erb、erc含量，是當(dāng)而紅霉素生產(chǎn)的一個(gè)重耍問(wèn)題6。發(fā)酵過(guò)程中可 能會(huì)產(chǎn)生某些雜質(zhì)，通過(guò)簡(jiǎn)單的預(yù)處理可能很難完全去除，會(huì)導(dǎo)致紅霉a、b、c的分離效 果不好，而常用的預(yù)處理方法在萃取紅霉素吋又會(huì)造成很大損失。所以這方面的研究還處 于試驗(yàn)階段。1.3紅霉素簡(jiǎn)介紅霉素是1952年從紅色鏈霉菌培養(yǎng)液屮分離出來(lái)的一種14元環(huán)大環(huán)內(nèi)醋類堿性 抗主素。它是口

13、色或類口色的結(jié)晶性粉末，微有吸濕性，味苦，易溶于醇類、丙酮、氯仿、 酯類（如乙酯、丁酯、戊酯等），微溶于乙瞇。在水屮的溶解度為2mg/ml （25°c左右），它 隨著溫度的升高而減少。在室溫和pll 68的條件卜：其溶液相當(dāng)穩(wěn)定，溫度升高穩(wěn)定性 下降。紅霉索熔點(diǎn)為135140°c （游離堿水合物）,190193°c （無(wú)水游離堿）。且具冇旋 光性和紫外吸收峰。紅霉素堿能和有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸類結(jié)合成鹽，其鹽類易溶于水7。我 國(guó)于1957年試制成功并投入生產(chǎn)。紅霉素是國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最廣的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素z-o紅霉素是廣譜抗生素，其抗菌譜 和青霉素g相似，特別對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、

14、抗酸桿菌、立克次氏體及病毒有抗菌活性，不 但出耐藥性金黃色葡萄球菌感染和溶血性鏈球菌感染所引致的疾病可以用紅霉索治療， 對(duì)青霉素過(guò)敏的患者也可以使用紅霉素。紅霉素在臨床上的應(yīng)用也很廣泛，主要用于呼吸 道感染、皮膚與軟組織感染、泌尿生殖系統(tǒng)感染及胃腸道感染等。另外，紅霉素是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。這類抗生素結(jié)構(gòu)具冇聚烯酮衍生的，被一內(nèi)酯鍵 閉合的大環(huán)內(nèi)酯骨架，并通過(guò)輕基以糖背鍵聯(lián)結(jié)13個(gè)罕有的中性或堿性糖?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu) 如下：n(ch3)3一0ch3ohch37“ -oh圖11-1 紅霉索類結(jié)構(gòu)通式14紅霉素的特點(diǎn)紅霉素是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的代表藥，其抗菌作用在同類中較強(qiáng)；在堿性環(huán)境中作用 較強(qiáng)，ph值小于

15、4吋幾乎沒(méi)冇抗菌作用；主要使用各種革蘭陽(yáng)性菌感染，特別是耐青霉索 的葡萄球菌感染和青霉素過(guò)敏的病人，還可用于白喉帶菌者、百日咳、軍團(tuán)菌、厭氧菌感 染等敏感性前列腺炎；口服大劑量可出現(xiàn)腸道反應(yīng)；紅霉素酯化物可引起肝臟損傷，停藥 后數(shù)h可恢復(fù)；靜脈用藥時(shí)宜用葡萄糖液而不用含鹽液體。1.5紅霉素的性狀紅霉素為口色或類口色的結(jié)晶或粉末；無(wú)臭，味苦；微有引濕性。在甲醇、乙醇或內(nèi) 酮屮易溶，在水屮極微溶解。1.6紅霉素的藥理作用類似節(jié)青霉素，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有強(qiáng)大抗菌作用，包拈金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、 白喉棒狀桿菌及梭狀芽砲桿菌；對(duì)革蘭陰性菌如腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血桿 菌、百日咳鮑特菌、布魯菌

16、有較強(qiáng)作用；對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌、支原體、衣原體、立克次體、螺 旋體也冇作用。常用于對(duì)青霉索耐藥的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌感染及對(duì)青霉索過(guò)敏的患者。首選于 軍團(tuán)菌肺炎、支原體肺炎、白喉帶菌者、沙眼衣原體所致的嬰兒肺炎及結(jié)腸炎；也可用于 扁桃體炎、中耳炎、鼻竇炎、大葉性肺炎等。第二章材料與方法2.1材料與儀器2.1.1試驗(yàn)材料本次試驗(yàn)材料取自學(xué)校實(shí)驗(yàn)室的紅霉索鏈霉菌2.1.2試驗(yàn)試劑甲基紅指示劑，酚瞅指示劑，次甲基藍(lán)，12%屮性甲醛，硼酸溶液，濃硫酸；葡萄糖：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純；乙酸：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純；無(wú)水乙瞇：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，分析純；次甲基藍(lán)：北京益利精細(xì)化學(xué)品有

17、限公司，分析純；亞鐵氧化鉀：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，分析純；kh2po4：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純；k2hpo4：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純；znso4：國(guó)約集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；naci：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純；naoh：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純；cuso4：國(guó)藥集i才i化學(xué)試劑有限公司，分析純；cu2o：北京益利精細(xì)化學(xué)品冇限公司，分析純；kmno4：北京益利糟細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純；ki：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任冇限公司，分析純。2.1.3試驗(yàn)儀器試管，移液管，培養(yǎng)皿，玻璃棒，燒杯，錐形瓶，量筒，堿式滴定管，酸式滴定管,膠頭滴管，蒸

18、發(fā)皿，石棉網(wǎng)，小漏斗，試管架，試管夾，漏斗，漏斗架；電了天平（fa2104；上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；分光光度i|（vis-7220n；北京瑞利分析儀器公司）；電熱恒溫水浴鍋（gsy10；北京市醫(yī)療設(shè)備廠）；臺(tái)式高速離心機(jī)（tgl-20；武漢中科儀器發(fā)展有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（re52-99；上海亞榮生化儀器廠）；索氏提取器（sxt-02；上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司）；凱式定氮裝置（sbd-100；北京市通潤(rùn)源機(jī)電技術(shù)冇限公司）；調(diào)溫電爐（sxl-1200；上海大恒光學(xué)精密機(jī)械有限公司）；酸度計(jì)（mp-9000；上海大恒光學(xué)精密機(jī)械有限公司）；水浴鍋（dzkw）, 100 ml三角瓶，10 m

19、l刻度吸管，25 ml刻度吸管，酸式滴定管，100 ml容量瓶，250 ml錐形瓶，大試管：9支，容量瓶：50mlx2,刻度吸管：lmlx3, 2mlxl, 5 mlxlo2.2試驗(yàn)方法紅霉素發(fā)酵屬于好氧發(fā)酵過(guò)程，在發(fā)酵過(guò)程中，需不斷通入無(wú)菌空氣并攪拌，以維持 一定的罐壓和溶氧。發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制發(fā)酵溫度、發(fā)酵液還原糖量、ph值、溶氧量及 發(fā)酵液粘度等，以便紅色糖多抱菌能夠大量合成紅霉素并排至胞外。生產(chǎn)屮還要加入消泡 劑以控制泡沐。在發(fā)酵期間每隔一定時(shí)間也要取樣進(jìn)行分析、鏡檢及無(wú)菌試驗(yàn)，檢測(cè)生產(chǎn) 狀況，分析或控制相關(guān)參數(shù)。2.2.1發(fā)酵液的預(yù)處理和過(guò)濾發(fā)酵液中除含有約0.8%的紅霉索外，絕大

20、部分是菌絲體、蛋白質(zhì)、色索、油等雜質(zhì)， 會(huì)給提取和精制帶來(lái)很大的閑難。尤以蛋白質(zhì)和油等的存在，在溶媒萃取吋將產(chǎn)生嚴(yán)重的 乳化現(xiàn)象。一般采用硫酸鋅沉淀蛋口質(zhì)，目的是使菌絲結(jié)成i才i加快過(guò)濾速度。因?yàn)榱蛩徜\ 呈酸性，為了防止紅霉素局部酸解而被破壞，我們一般要用naoh來(lái)調(diào)節(jié)ph值。在處理濾 渣時(shí)也會(huì)遇到一些問(wèn)題，因?yàn)殇\離了是有毒性的，所以我們改用堿式氯化鋁處理濾渣。經(jīng) 過(guò)預(yù)處理的發(fā)酵液便可進(jìn)行過(guò)濾去除菌絲體及沉淀的蛋白質(zhì)。紅霉索發(fā)酵液過(guò)濾采用板框 過(guò)濾機(jī)。222紅霉素的提取紅霉素分子結(jié)構(gòu)中有一個(gè)二卬基氨基官能團(tuán)，是一個(gè)弱堿，在酸性條件下與某些酸會(huì) 形成鹽，如紅霉素乳酸鹽。如杲是純紅霉素堿那么在水中

21、溶解度較小，并且會(huì)隨溫度升高 而減小，在55°c時(shí)溶解度最小，當(dāng)ph>10.0吋紅霉索基本以游離堿的形式存在，能溶于 乙酸丁酯中，當(dāng)ph<6.0時(shí)，紅霉素以鹽的形式存在，其在水屮的溶解度隨ph降低而迅 速增大。提取方法是在乙酸丁酯及水溶液（乙酸緩沖液）中反復(fù)萃取。2.2.3發(fā)酵方法a.搖瓶培養(yǎng)用種子培養(yǎng)冷凍管取紅霉索菌種接種于30度母斜面上，養(yǎng)7d接種于30度子斜面繼 續(xù)培養(yǎng)，7d后接種于一級(jí)種子瓶。30000r/min培養(yǎng)48-56h轉(zhuǎn)入二級(jí)種子瓶30000r/min繼 續(xù)培養(yǎng)26-30h,發(fā)酵培養(yǎng)將上培養(yǎng)好的二級(jí)種子接種于發(fā)酵瓶，30000r/min培養(yǎng)16h。 搖瓶

22、裝液量為50ml/250ml,每組結(jié)果均為5只搖瓶的平均效價(jià)。b.發(fā)酵罐培養(yǎng)種子培養(yǎng)的步驟與搖瓶培養(yǎng)相同，發(fā)酵培養(yǎng)就是將上而培養(yǎng)好的二級(jí)種子接種丁 3l 發(fā)酵罐動(dòng)發(fā)酵，同時(shí)控制發(fā)酵罐的發(fā)酵溫度、pii、接種量、攪拌速度和溶解氧等條件， 培養(yǎng)16ho第三章試驗(yàn)結(jié)果3.1選因素、定水平(1) 僅超聲波誘變法定水平分別取10ml出發(fā)菌株的菌懸液于30支25ml的試管中，放入超聲波清洗器 中，水淹沒(méi)至試管2/3左右，進(jìn)行超聲波處理。超聲波功率分別為200w、300w、 400w,誘變時(shí)間分別為 0min> 3min、6min> 9min> 12min> 15min> 18

23、min 2min> 24min> 27min> 30mino根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)：隨著超聲波誘變時(shí)間的增長(zhǎng)，紅色糖多胞菌的致死 率都在不斷的增加；在3個(gè)不同功率的超聲波誘變中，超聲波功率為200v時(shí)， 隨著誘變時(shí)間的增長(zhǎng)，致死率上升得不明顯，誘變效果不顯著；超聲波功率為 400wii寸，紅色糖多胞菌很快就全部致死，反而沒(méi)有達(dá)到誘變效果；超聲波功率 為300w時(shí)，誘變時(shí)間20min,致死率接近83%,且平板上的紅色糖多胞菌菌落 大小不均一，誘變效果較好。(2) 僅licl誘變法定水平licl誘變法定水平的實(shí)驗(yàn)采用兩種方法：一是在培養(yǎng)基中加入不同濃度的 氯化鋰；二是用不同濃度的氯

24、化鋰處理泡子后在培養(yǎng)。根據(jù)菌株致死率來(lái)判斷誘 變效果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：第一種方法能取得比較好的致死效果，可能是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)的 過(guò)程中，培養(yǎng)基中始終有氯化鋰存在，對(duì)紅色糖多胞菌起著長(zhǎng)期誘變的作用，因 此誘變效果更好。隨著氯化鋰濃度的提高，致死率也隨著提高，當(dāng)氯化鋰濃度超 過(guò)0.5%吋，紅色糖多胞菌的致死率增加幅度不在顯著，因此在誘變屮氯化鋰濃 度確定為0.5%。在正交實(shí)驗(yàn)中，氯化鋰濃度分別選0.3%、0.4%、0.5%三個(gè)水平, 并分別采用兩種方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體情況選定的因素及其水平：因索b超聲波功率(w)水平：200w300w400w因素誘變時(shí)間(min)水平：lomin20min 30m

25、in因素c:licl濃度(%)水平:0. 30. 40. 5因素d： licl使用方法水平：1、培養(yǎng)基屮加入licl 砲子懸浮液里4h同時(shí)處理可以確定此實(shí)驗(yàn)為四因素、三水平實(shí)驗(yàn)，可以選擇止交表l9(31)項(xiàng)目1234111112122231333421235223162312731328321393321表頭設(shè)計(jì)水平a、超聲波功率b、誘變時(shí)間c、lici濃度d、lici使用方法(w)(min)(%)1200100.3培養(yǎng)基中加lici2300200.4砲了懸浮液處理3400300.5同時(shí)處理頂行：實(shí)驗(yàn)考慮的因索最左列：實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的次數(shù)，每一列代表試驗(yàn)中安排的各個(gè)因素的水平3. 2實(shí)驗(yàn)方案及其實(shí)驗(yàn)

26、結(jié)果水平a、超聲波功率(w)b、誘變時(shí)間(min)c、lici濃度(%)d、lici使用方法1200100.3培養(yǎng)基中加lici2300200.4殖子懸浮液處理3400300.5同時(shí)處理試驗(yàn)號(hào)abcd生物效價(jià)(ug)111114410212224464313333221421233100522314702623124649731323321832133617933213867試驗(yàn)號(hào)abcd生物效價(jià)(ug)111114410212224464313333221421233100522314702623124649731323321832133617933213867ki4032361042254

27、326k2415042613810414535351k33602391237483313r5486514771013(1) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果中重要數(shù)據(jù)的計(jì)算方法：kl即第j列上水平號(hào)為1的各實(shí)驗(yàn)結(jié)果之和的平均值k2即第j列上水平號(hào)為2的各實(shí)驗(yàn)結(jié)果之和的平均值k3即笫j列上水平號(hào)為3的各實(shí)驗(yàn)結(jié)果之和的平均值r即第j列的極差或其所在因素的極差(2) 計(jì)算公式:rj=maxkj-minkjr值(極差)的作用，一般來(lái)說(shuō)，各列的r值(極差)是不相等的，這說(shuō)明各因 素改變吋對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響是不相同的。極差越大，說(shuō)明這個(gè)因素的水平的改變 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響越大。極差最大的那一列的因素，就是因素的水平改變對(duì)實(shí)驗(yàn) 結(jié)果影

28、響最大的因素，也就是最主要的因素。本題屮：d>b>a>c,即因素的影響程 度為：氯化鋰使用方法超聲波誘變時(shí)間 >超聲波功率氯化鋰濃度。(3) 分析結(jié)果確定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案挑選因素的最優(yōu)水平與所要求的指標(biāo)有關(guān)，若指標(biāo)越大越好，則應(yīng)該選取使 指標(biāo)大的水平，即各列k叮、k2j、k3j中最大的那個(gè)水平：反之，若指標(biāo)越小越 好，則應(yīng)該選取使指標(biāo)小的那個(gè)水平。本題屮的實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)是捉高紅霉素的產(chǎn)量, 指標(biāo)越大越好，所以應(yīng)該選取每個(gè)因素的klj、k2j k3j中最大的那個(gè)水平。結(jié) 合表中可以得到實(shí)驗(yàn)號(hào)為1、2、5、6的誘變菌株的相對(duì)效價(jià)較高，其中5號(hào)菌 株的效果最好，其最佳誘變方法為將5號(hào)菌

29、株進(jìn)行檢測(cè)，其發(fā)酵水平比出發(fā)菌株 提高了很多。5號(hào)菌株即為正交實(shí)驗(yàn)所得到的最優(yōu)結(jié)果(4) 小結(jié)：止交實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)：1、實(shí)驗(yàn)次數(shù)太多，費(fèi)時(shí)、費(fèi)事；2、不做重復(fù)實(shí)驗(yàn)就無(wú)法估計(jì)誤差；3、無(wú)法區(qū)分因素的主次；正交實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)：1、試驗(yàn)點(diǎn)代表性強(qiáng)，試驗(yàn)次數(shù)少；2、不需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)，就可以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差；3、可以分清因素的主次；4、可以使用數(shù)理統(tǒng)計(jì)的方法處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提出好的條件；試驗(yàn)號(hào)abcd生物效價(jià)(ug)111114410212224464313333221421233100522314702623124649731323321832133617933213867k14032361042254326k241

30、5042613810414535351k33602391237483313r5486514771013因素主次：d>b>a>c最優(yōu)方案：a2b2c3d13. 3菌種的初篩與馴化如杲通過(guò)口然篩選獲得高效菌種需要較長(zhǎng)的時(shí)間，所以通過(guò)人工富集培養(yǎng)分 離，篩選出降解能力強(qiáng)的高效菌株，是篩選鑒定過(guò)程中獲取適宜菌種的冇效途徑。 我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室采用富集培養(yǎng)的方法，從自然界篩選馴化降解紅霉素的高效菌株， 并對(duì)菌株進(jìn)行初步的鑒定，研究外界的營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境對(duì)條件對(duì)菌株生t的影響，以 便在實(shí)際應(yīng)用屮通過(guò)控制適當(dāng)?shù)臈l件達(dá)到最佳的生長(zhǎng)效果。3. 4紅霉素產(chǎn)生菌的篩選和鑒定將含有所要篩選的微生物的污泥按搖瓶培

31、養(yǎng)的步驟操作，分別往50ml普通 培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基屮加入5ml活性污泥33°c厭氧條件下進(jìn)行富集培養(yǎng)。取5ml 最終富集液分別接種于紅霉素濃度為100mg/l的馴化培養(yǎng)基中，在33°c厭氧條件 下培養(yǎng)48ho取培養(yǎng)后的該培養(yǎng)液5ml再接種馴化培養(yǎng)基中，紅霉索濃度為 200mg/l,在上述條件繼續(xù)卜培養(yǎng)。重復(fù)上述過(guò)程，馴化培養(yǎng)基中抗生素含量逐漸 加大，而碳氮源的含量逐漸降低，直至紅霉索濃度達(dá)到2000mg/lo菌種的復(fù)篩與分離純化達(dá)到口標(biāo)濃度后，取一環(huán)菌懸液按稀釋、平板分離法 進(jìn)行操作，待菌株生長(zhǎng)后,選取長(zhǎng)勢(shì)最好，且形態(tài)穩(wěn)定相似的菌落按三平板劃線分 離法進(jìn)一步分離純化，最后

32、在馴化培養(yǎng)基一屮獲得3株菌株，對(duì)它們進(jìn)行編號(hào)分 別為:a、b和c,接種至斜面并保存于冰箱中，以備進(jìn)一步的馴化以及后續(xù)試驗(yàn)使 用。3. 5菌株的生物學(xué)特性及鑒定3. 5. 1菌株的形態(tài)特征經(jīng)過(guò)馴化篩選后得到的幾株菌株的形態(tài)特征如下a:在牛肉膏蛋白月東固體培養(yǎng)基上菌落呈略黃色,半透明，表面隆起，光滑但不 濕潤(rùn)，中間顏色較周邊深，菌落呈不規(guī)則狀且較小,邊緣呈波狀。在固休培養(yǎng)基平 板的表而、屮部和底部都冇生長(zhǎng)，這表明a為兼性厭氧菌。用光學(xué)顯微鏡觀察該 菌的菌體形狀呈短桿狀,革蘭氏染色后菌體呈紫紅色，判斷為革蘭氏陰性菌;無(wú)莢 膜，無(wú)芽砲。在牛肉膏蛋白月東固體培養(yǎng)基上菌落呈淡黃色,不透明，表面呈凸透鏡狀，

33、光 滑濕潤(rùn)，菌落呈不規(guī)則狀且較小，邊緣規(guī)則口光滑。在固體培養(yǎng)基平板的表面、中 部和底部都冇生長(zhǎng),這表明b為兼性厭氧菌。用光學(xué)顯微鏡觀察，該菌的菌體形狀 呈球狀，革蘭氏染色后菌體呈紫紅色,屈于革蘭氏陰性菌;無(wú)莢膜，無(wú)芽抱。c:在牛肉膏蛋白脈固體培養(yǎng)基上菌落呈黃色，不透明，表面呈凸透鏡狀，光滑 較濕潤(rùn)，菌落呈圓形，邊緣規(guī)則且光滑。在固體培養(yǎng)基平板的表面、屮部和底部都 有牛比這表明c為兼性厭氧菌。用光學(xué)顯微鏡觀察，該菌的菌體形狀呈桿狀，革 蘭氏染色后菌體呈紫紅色,屈于革蘭氏陰性菌;無(wú)莢膜，無(wú)芽砲。3. 5. 2菌株的生理生化特征(1)唯一碳源試驗(yàn)?zāi)緦?shí)驗(yàn)的原理是不同菌種在碳源一樣的培養(yǎng)基中，由于其利用

34、情況不同會(huì)影 響菌株的生長(zhǎng)，我們可以根據(jù)菌株生長(zhǎng)情況來(lái)判斷其對(duì)該碳源的利用情況。所以 我們將a、b和c接種到這種特定的含各種不同氮源的碳源試驗(yàn)培養(yǎng)基上后，各培 養(yǎng)基中菌株的牛長(zhǎng)情況如下表所示：唯一碳源實(shí)驗(yàn)結(jié)杲菌種編號(hào)葡萄糖乙醇蔗糖dl-甲硫氨基酸檸檬酸草酸a+b+c+上表說(shuō)明a能夠利用葡萄糖、乙醇、蔗糖、dl-甲硫氨基酸、檸檬酸和草酸 作為唯一碳源;b能夠利用葡萄糖、乙醇、蔗糖、di廠甲硫氨基酸為唯一碳源，不 能利用檸檬酸和草酸;c能夠利用葡萄糖、乙醇、蔗糖為唯一碳源，不能利用dl- 甲硫氨基酸、檸檬酸和草酸。(2)唯一氮源試驗(yàn)唯一氮源試驗(yàn)就是在碳源不同而氮源卻唯一確定的的情況下看看各菌株的

35、利用情況，所以要將a、b和c接種特定試驗(yàn)培養(yǎng)基上，我們通過(guò)看各培養(yǎng)基中菌 株的生長(zhǎng)情況來(lái)判斷利用狀況。唯一氮源實(shí)驗(yàn)結(jié)果菌種編號(hào)硫氨酸酵母膏硝酸胺蛋白月東硝酸鉀a+b+c+上表說(shuō)明a和b能夠利用硫酸按、酵母膏、硝酸按、蛋白膿和硝酸鉀作為唯 一氮源;而c能夠利用硫氨酸、酵母膏和硝酸胺作為唯一氮源，卻不能利用蛋口陳 和硝酸鉀。(3) 運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)將接種過(guò)三種菌種的試管分別直立放于試管架上，并把它們放在恒溫箱中用 適宜溫度培養(yǎng)，經(jīng)定期觀察發(fā)現(xiàn),a、b、c接種后菌株僅在在接種線處生長(zhǎng)，細(xì)而 密，并未出現(xiàn)擴(kuò)散。這說(shuō)明a、b、c都不具有運(yùn)動(dòng)性。(4) 糖、醇、糖昔類碳源的分解試驗(yàn)不同的細(xì)菌在分解糖或醇(如葡萄

36、糖、乳糖、蔗糖、li露醇、廿油)的能力上 有很大茅異。菌種在發(fā)酵后能產(chǎn)生各種有機(jī)酸（如乳酸、醋酸、甲酸琥珀酸）及各 種氣體（如也、c02、chj。酸的產(chǎn)生可以用指示劑來(lái)指示。我們?cè)谂渲婆囵B(yǎng)基吋 預(yù)先加入澳百里酚藍(lán)，當(dāng)細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)酸吋，培養(yǎng)基的顏色就會(huì)由紫色變?yōu)辄S色。氣 體的產(chǎn)生可由糖發(fā)酵管中倒立的杜氏小管中的氣泡的有無(wú)來(lái)證明。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下所示，a菌種的發(fā)酵結(jié)果既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，b菌種能產(chǎn)酸但不產(chǎn) 氣，c菌種既不產(chǎn)酸又不產(chǎn)氣。糖、醇、糖昔類碳源的分解實(shí)驗(yàn)結(jié)果菌種abc實(shí)驗(yàn)結(jié)果+注：+表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣+表示產(chǎn)酸不產(chǎn)氣表示不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣（5）淀粉水解試驗(yàn)我們知道，有些菌種可以合成淀粉酶并把它分泌到胞外。而淀粉酶

37、可以把淀 粉水解為麥芽糖和葡萄糖。淀粉的特性是遇碘變藍(lán)，但淀粉水解后遇碘不再變藍(lán)。 我們可以在充分生長(zhǎng)后的a、b、c淀粉水解培養(yǎng)基上滴加碘液，看是否有藍(lán)色出 現(xiàn)。試驗(yàn)結(jié)果為菌落周圍仍為藍(lán)黑色，無(wú)水解圈產(chǎn)生。由此可見(jiàn)，菌株a、b、c 都不具有淀粉水解能力。淀粉水解試驗(yàn)結(jié)果菌種abc實(shí)驗(yàn)結(jié)果注：一農(nóng)示沒(méi)有淀粉水解能力（6）卬基紅試驗(yàn)設(shè)計(jì)該實(shí)驗(yàn)的目的是想看看菌株是否能分解葡萄糖產(chǎn)酸。某些菌株在糖代謝 過(guò)程中，將培養(yǎng)基中的糖先分解為丙酮酸，丙酮酸再被分解為甲酸、乙酸、乳酸等。 因?yàn)榕囵B(yǎng)液屮含有有機(jī)酸，我們可以加入甲基紅指示劑看培養(yǎng)液顏色變化來(lái)進(jìn)行 檢驗(yàn)。卬基紅試驗(yàn)結(jié)果菌種abc實(shí)驗(yàn)結(jié)果+結(jié)果表明a、b

38、、c培養(yǎng)24h后，在培養(yǎng)液屮加入甲基紅指示劑,a的培養(yǎng)液的 顏色變化是由黃色變?yōu)榧t色和c的培養(yǎng)液仍為黃色。這說(shuō)明菌株a的培養(yǎng)液中含有有機(jī)酸，b、c培養(yǎng)液中沒(méi)有產(chǎn)生有機(jī)酸。(7) 乙酰甲基甲醇試驗(yàn)?zāi)驹囼?yàn)用的是間接測(cè)定法，細(xì)菌在分解葡萄糖的過(guò)程屮會(huì)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，而 我們就是通過(guò)檢測(cè)這種代謝產(chǎn)物來(lái)檢測(cè)該種細(xì)菌。乙酰甲基甲醇是丙酮酸脫竣縮 合和脫竣后轉(zhuǎn)變而成的，丙酮酸又是葡萄糖的代謝產(chǎn)物。乙酰卬基叩醇在堿性條 件下，被空氣中的氧氣氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白豚中的精氨酸的呱基起作用 生成紅色化合物，此為vp.正反應(yīng)。我們?cè)谂囵B(yǎng)基中加入乙酰甲基甲醇，看微生 物能否分解這種代謝產(chǎn)物來(lái)判定微牛物的種類。試驗(yàn)結(jié)

39、果如下所示，表明a、b、c、三種菌種都不能分解乙酰甲基甲醇。乙酰卬基卬醇試驗(yàn)菌種abc實(shí)驗(yàn)結(jié)果一一一 一(8) 檸檬酸鹽試驗(yàn)因?yàn)橛行┘?xì)菌可分解檸檬酸形成co。而培養(yǎng)基屮鈉離子可以形成碳酸鈉，使 培養(yǎng)基的堿性增加，我們可以在培養(yǎng)基小加入指示劑，根據(jù)培養(yǎng)基屮的指示劑變 色情況來(lái)判斷試驗(yàn)結(jié)果。我們使用的指示劑是1%的澳百里酚藍(lán)酒精溶液,它的變 色范圍為ph6. 3-7. 6,顏色變化是由黃到藍(lán);也可以用酚紅水溶液作為指示劑，其 變色范圍ph6. 3-8.0,顏色變化為由黃到紅。試驗(yàn)結(jié)果如下所示，結(jié)果表明,a具有利用檸檬酸的能力b、c不能利用檸檬 酸。檸檬酸鹽試驗(yàn)菌種abc實(shí)驗(yàn)結(jié)果+注：+表示能利用表

40、示不能利用3. 6菌種鑒定通過(guò)以上多個(gè)實(shí)驗(yàn)的綜合結(jié)果，我們初步確定了微生物的種類，現(xiàn)在將結(jié)果 匯總展示如下：結(jié)果實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目abc細(xì)胞形狀短針球形桿狀形成芽泡無(wú)無(wú)無(wú)有英膜無(wú)無(wú)無(wú)革蘭氏染色陰性陰性陰性好氧性兼性厭氧兼性厭氧兼性厭氧運(yùn)動(dòng)性無(wú)無(wú)無(wú)糖、醇、糖甘類碳+源分解實(shí)驗(yàn)淀粉水解實(shí)驗(yàn)甲基紅實(shí)驗(yàn)+乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)+初步鑒定結(jié)杲表明a為克雷伯氏菌屈，b為氨基酸球菌屈，c為變形菌屈第四章討論木次課題的研究都是基于實(shí)驗(yàn)操作的基礎(chǔ)之上的，是在老師的指導(dǎo)下順利完 成的，實(shí)驗(yàn)過(guò)程盡量要求準(zhǔn)確，避免可能出現(xiàn)的錯(cuò)誤和漏洞，具有科學(xué)依據(jù)。菌種的篩選需要大量的實(shí)驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)我們都設(shè)冇對(duì)照，旨在準(zhǔn)確的的得到 試驗(yàn)

41、結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們也許會(huì)遇到一些難以避免的問(wèn)題，比如發(fā)酵過(guò)程中 的污染問(wèn)題、溶氧量的控制問(wèn)題，在紅霉索的生產(chǎn)過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)紅霉索降解 問(wèn)題，還有其含有的雜質(zhì)可能會(huì)影響紅霉素產(chǎn)量和質(zhì)量。紅霉素發(fā)酵屬于有氧發(fā) 酵，其中的好氧菌可能會(huì)爭(zhēng)奪一部分氧分而導(dǎo)致發(fā)酵罐通氧量不足，紅霉素產(chǎn)量 受到影響。所以在發(fā)酵過(guò)程屮可以不斷監(jiān)測(cè)可控條件的變化,及時(shí)做出應(yīng)對(duì)措施, 使損失降到最低。篩選的過(guò)程我們也耍求準(zhǔn)確，影響菌種的因素我們都有考慮在 內(nèi)，實(shí)驗(yàn)最終得出了結(jié)果。結(jié)論木次課題的實(shí)驗(yàn)是在安陽(yáng)工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成，從接種到發(fā)酵再到后來(lái)的菌種 篩選及鑒定都有作者和老師共同完成。在正交試驗(yàn)時(shí)，我們選定的是四因素三水平，

42、我們比較了各個(gè)菌種的形態(tài)特 征，菌落特征，有無(wú)莢膜和革蘭氏染色情況等等。通過(guò)對(duì)各種菌種的形態(tài)和性能 對(duì)比，我們篩選岀來(lái)的優(yōu)質(zhì)的、符合我們要求的菌種是克雷伯氏菌屬、氨基酸球 菌屬和變形菌屬。同時(shí)，通過(guò)這次課題研究我也學(xué)習(xí)到了紅霉素對(duì)于抗牛素領(lǐng)域的重要意義， 對(duì)于指導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)也具冇很大的意義和價(jià)值，只冇懂得了菌種的篩選要求及鑒定 準(zhǔn)則才能提高紅霉素質(zhì)量，更好的服務(wù)于人們的生活。參考文獻(xiàn)1 范代娣，陳斌，尚龍安.紅霉素發(fā)酵工藝優(yōu)化研究j生物工程學(xué)報(bào),1999, 12(5): 106-110.2 肖懷秋，李玉珍.微牛物培養(yǎng)基優(yōu)化方法研究進(jìn)展j.釀酒科技,2010,21(1):90-94. 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典m.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社,1986: 2271-2272.4左勇，李楊，謝暉，等.紅霉素?fù)u瓶發(fā)酵控制條件的優(yōu)化j.四川理工學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科 學(xué)版)z 2012(4): 17-20.左勇，李楊，任永利，等.紅霉素產(chǎn)牛菌的誘變及培養(yǎng)基優(yōu)化研究j.四川