羊肚菌菌核發(fā)育形態(tài)、IMV檢測及原生質體融合技術研究

1、羊肚菌菌核發(fā)育形態(tài)、 IMV 檢測及原生質體融合技術研究 羊肚菌在生物分類上屬于子囊菌門 ,為世界著名的食藥兼用用菌 , 風味獨特 , 并具有抗氧化、消炎、抗菌、免疫刺激和抗腫瘤等多種生物活性。2012年以來 ,羊肚菌大田栽培首次在我國四川成功實施 , 并快速向全國輻射。然而,與羊肚菌人工栽培快速發(fā)展形勢不相稱的是 , 羊肚菌的基礎理論研究 還比較落后 , 限制了羊肚菌產業(yè)的持續(xù)健康和穩(wěn)定發(fā)展。 譬如,羊肚菌菌核發(fā)育機 制、菌種質量評價、育種新技術應用等研究 , 將促進羊肚菌生產的健康發(fā)展。本研究采用電子顯微術和激光共聚焦顯微術研究了羊肚菌菌核發(fā)育過程中 的形態(tài)和生理變化 ,發(fā)現(xiàn)羊肚菌菌核發(fā)育

2、涉及了自噬、 凋亡和壞死等事件 , 羊肚菌 菌核的能量儲存物質為脂肪 ; 建立了羊肚菌栽培菌株身份( identity )、交配型(mating type )和活力(vitality )的IMV檢測技術,可用于羊肚菌人工栽培菌 株在大生產中的適應性檢驗 ; 優(yōu)化了羊肚菌原生質體釋放和再生技術 , 建立了梯 棱羊肚菌和六妹羊肚菌種間雙滅活融合技術 , 獲得了一批融合菌株 , 對推動羊肚 菌原生質體融合育種技術發(fā)展具有現(xiàn)實意義。 主要研究結果如下 : ( 1)對梯棱羊 肚菌 1號菌株,菌絲重復分枝和末端菌絲或亞末端菌絲分枝的擴大形成菌核原基 其菌核發(fā)育兼具末端型和側生型特性 , 為復合型 ; 透射

3、電子顯微術研究發(fā)現(xiàn)羊肚 菌菌核發(fā)育涉及了自噬、凋亡和壞死事件 ; 活細胞共聚焦激光成像研究揭示了菌 核中的能量儲存物質為脂質性質。脂肪的定性測定表明 ,菌核中積累的脂肪多于營養(yǎng)菌絲細胞。 (2)分別采用ITS-1/ITS-4、RPB1B-F/RPB1B-RRPB2B-F/RPB2B-引物對實驗室保存的 6 種羊 肚菌的基因組DNA進行PCRT增,測定了其ITS、RPB1BRPB2BS因序列,并進行 了序列比對分析結果表明,菌株4號和XuChang為梯棱羊肚菌(Morchella importuna ),菌 株 201、13 號、SZL-3 號為六妹羊肚菌(Morchella sextelata

4、 ),菌株 CuBing與 Morchella kaibabensis 同源相似性為 98.9%,可信度為 100%。設計和篩選了 羊肚菌交配型基因測定的特異性引物 , 發(fā)現(xiàn)引物對 Mat1-1/Mat1-1-1 可特異性鑒 定六妹羊肚菌的交配型 , 引物對 Mat1-1-1/Mat1-2-1 能夠鑒定梯棱羊肚菌的交配 型。采用篩選的引物對分別對測定的六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌菌株的基因組DNA進行PCFT增,發(fā)現(xiàn)每對引物均能擴增出1條清晰的條帶,并且混合引物均能 擴增出兩個條帶。這些結果表明 ,篩選的引物對可用于六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌 菌株的交配型分析 ,測試的六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌菌株均未發(fā)生

5、交配型缺失 , 六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌均屬于典型的異宗結合真菌。測定了六個羊肚菌菌株的脂質過氧化水平 ,評價菌株的衰老情況。 結果發(fā)現(xiàn), 菌株SZL-3和CuBing老化程度最高,菌株201、13號活力最強,菌株4號、XuChang 老化程度介于二者之間。(3)對梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌原生質體釋放條件進行了優(yōu)化。 結果表明, 梯棱羊肚菌原生質體制備的最優(yōu)條件為 :穩(wěn)滲劑為 0.6 M 甘露醇,酶液體系為 2% 溶壁酶+ 1 %蝸牛酶+ 1 %纖維素酶,菌齡為3 d。在該優(yōu)化條件下,梯棱羊肚菌原生質體產量為1 x 10⁶個/mL,原 生質體再生率可達

6、 1.8%。六妹羊肚菌原生質體制備最佳條件為 :穩(wěn)滲劑為 0.6 M 甘露醇,酶液體系為 2%溶壁酶+1 %蝸牛酶+1 %纖維素酶,菌齡為 3 d。在該優(yōu)化條件下,六妹羊肚菌原生質體產量為6.5 x 10⁵個/mL,原生質體再生率可達 1.5%。(4)優(yōu)化了梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌種間雙滅活原生質體融合條件結果表明,2 種羊肚菌種間原生質體融合的最優(yōu)條件為 : 原生質體融合溫度25C,溶液 pH 8.0,CaCI₂ 終濃度 50 mmol/L,融合劑 PEG濃度 25% 在優(yōu)化條件下 , 原生質體融合率可

7、達 0.8%。（5）篩選了鑒定 2 種羊肚菌的特異性 RAP（Drandom amplified polymorphism DNA隨機擴增多態(tài)性DNA分子標記。測定了 2親本及融合子的RAP標記,通過 聚類分析發(fā)現(xiàn)雙親本與融合子可分為 3 大類群:第一類群包括親本梯棱羊肚菌 （P1）, 第二類群包括所有融合子 , 第三類群包括親本六妹羊肚菌（ P2）。16 個融合子可以分為 3組, 其中 1、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、 16為一組,4 、7為一組, 2 、3為一組。這些結果表明 ,采用梯棱羊肚菌和六妹羊 肚菌種間雙滅活融合技術獲得的羊肚菌原生質體融合子為真正的融合子。

8、（6）分別選取融合子1號（R1）、融合子2號（R2）、融合子4號（R4）、和 雙親本進行培養(yǎng) , 比較每種融合子和雙親本菌株的菌落形態(tài)差異 , 發(fā)現(xiàn)梯棱羊肚 菌（P1）、六妹羊肚菌（P2）、R1、R2、R4均產菌核且產量多，菌核形態(tài)均為點狀； 按照菌絲生長速度 ,各菌株的排列順序為 :R4>P1>P2>R2>R1, 但5菌 株生長速度相差不大；不同菌株的菌塊恢復時間不同，其中P2恢復時間最長,P1 恢復時間最短,1號、2號和4號融合子介于二者之間；P1、R1、R2、R4的菌絲緊 密、P2稀疏;所有菌株菌落邊緣均整齊。這些結果表明,2種羊肚菌的融合子為真 正的融合菌株。（7）人工栽培發(fā)現(xiàn)，融合子R1和R4子囊果形態(tài)上接近2號親本（P2,為六 妹羊肚菌）,R5和R8形態(tài)接近于1號親本（P1,為梯棱羊肚菌），而R2和R3介 于兩親本之間。（8）人工栽培表明 ,2 親本與 6個融合子 8個菌株產量之間均差 異顯著,沒有任何融