蛋白質(zhì)的定量測(cè)定方法

1、實(shí)驗(yàn) 蛋白質(zhì)的定量測(cè)定方法【實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)】1.試比較Folin酚法與考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合比色法的優(yōu)缺點(diǎn)。2.試比較二喹啉甲酸法與Folin酚法的優(yōu)缺點(diǎn)。3.凱氏定氮法中在消化樣品時(shí)，加入濃硫酸，硫酸鉀和硫酸銅粉末的目的是什麼？4.紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理是什麼？一、Folin酚試劑法(Lowry法)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.學(xué)習(xí)Folin酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理。2.掌握Folin酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法和操作。【實(shí)驗(yàn)原理】蛋白質(zhì)中含有酪氨酸和色氨酸殘基，能與Folin酚試劑起氧化還原反應(yīng)。反應(yīng)過程分為兩步，第一步：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu2+作用生成蛋白質(zhì)Cu2+復(fù)

2、合物；第二步：蛋白質(zhì)Cu2+復(fù)合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。該呈色反應(yīng)在30分鐘內(nèi)即接近極限，并且在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。進(jìn)行測(cè)定時(shí)要根據(jù)蛋白質(zhì)濃度的不同選用不同的測(cè)定波長：若蛋白質(zhì)含量高時(shí)（25100g）在500nm波長處進(jìn)行測(cè)定，含量低時(shí)(525g)在755nm波長處進(jìn)行測(cè)定。最后根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品中蛋白質(zhì)的含量。Folin酚試劑法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，樣品中蛋白質(zhì)含量高于5g即可測(cè)得，是測(cè)定蛋白質(zhì)含量應(yīng)用得最廣泛的方法之一?！緦?shí)驗(yàn)用品】1.實(shí)驗(yàn)器材100毫升容量瓶

3、2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；分光光度計(jì)。2.實(shí)驗(yàn)試劑(1)Fo1in酚試劑甲：將lg碳酸鈉溶于50mL0.lmolL氫氧化鈉溶液中，再把0.5g硫酸銅(CuSO45H2O)溶于100mL1酒石酸鉀(或酒石酸鈉)溶液，然后將前者50mL與后者lmL混合。混合后1日內(nèi)使用有效。(2)Folin酚試劑乙：在1.5L容積的磨口回流瓶中加入100g鎢酸鈉(Na2WO42H2O)、25g鉬酸鈉(Na2MoO42H2O)、700mL蒸餾水、50mL85磷酸及100mL濃鹽酸，充分混勻后回流10h?；亓魍戤?，再加150g硫酸鋰、50mL蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴，冷卻后

4、定容到1000mL。過濾，如顯綠色，可加溴水?dāng)?shù)滴使氧化至溶液呈淡黃色。置于棕色瓶中暗處保存。使用前用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，酚酞為指示劑，以標(biāo)定該試劑的酸度，一般為2molL左右(由于濾液為淺黃色，滴定時(shí)濾液需稀釋100倍，以免影響滴定終點(diǎn)的觀察)。使用時(shí)適當(dāng)稀釋(約1倍)，使最后濃度為lmolL酸。(3)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用分析天平精密稱取牛(或人)血清白蛋白100毫克，用少量蒸餾水完全溶解后，轉(zhuǎn)移至100毫升容量瓶中，準(zhǔn)確稀釋至刻度，使蛋白質(zhì)濃度1mg/mL。(4)樣品溶液：配制約0.5mg/mL的酪蛋白溶液作為未知樣品溶液?！痉椒ú襟E】1. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支試管，按下表分別加入各試劑各管加

5、入Fo1in酚試劑乙后，立即搖勻，放置30分鐘后比色，在500nm處記下各管光密度，以0號(hào)管為對(duì)照，以光密度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2. 測(cè)定未知樣品：取2支試管，分別準(zhǔn)確吸取1毫升樣品溶液，各加5毫升Fo1in酚試劑甲，搖勻，室溫放置10分鐘后，再各加1毫升Fo1in酚試劑乙，立即搖勻，放置30分鐘，在500nm處測(cè)定光密度值。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】根據(jù)未知樣品溶液的光密度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量?！咀⒁馐马?xiàng)】注意要準(zhǔn)確配制所用試劑，準(zhǔn)確量取各溶液?！緦?shí)驗(yàn)報(bào)告】總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并分析評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。二、紫外吸收法【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 學(xué)習(xí)紫外吸收法測(cè)定蛋

6、白質(zhì)含量的原理。2. 掌握紫外分光光度計(jì)的操作方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】大多數(shù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）殘基，使蛋白質(zhì)在280nm的紫外光區(qū)產(chǎn)生最大吸收，并且這一波長范圍內(nèi)的吸收值與蛋白質(zhì)濃度的成正比，利用這一特性可定量測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。紫外吸收法可測(cè)定0.1-0.5mg/ml的蛋白質(zhì)溶液，此操作簡(jiǎn)便，測(cè)定迅速，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定。因此，此法在蛋白質(zhì)的制備中廣泛應(yīng)用。【實(shí)驗(yàn)用品】1.實(shí)驗(yàn)器材試管及試管架；50毫升容量瓶2只；移液管；紫外分光光度計(jì)。2.實(shí)驗(yàn)試劑(1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：精確配制2mgmL的酪蛋白溶液。(2)樣品溶液：配制約0.5mg/mL的酪蛋白溶液作

7、為未知樣品溶液。【方法步驟】1. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取 7 支試管按下列各表加入各試劑：試劑加完后搖勻，在紫外分光光度計(jì)上，于280nm處以0號(hào)管為對(duì)照，分別測(cè)定各管溶液的光密度值。以光密度為縱座標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液濃度為橫座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.測(cè)定未知樣品取樣品溶液4毫升,加蒸餾水4mL混勻，在280nm下測(cè)定其光密度值?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】根據(jù)樣品溶液的光密度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液的蛋白質(zhì)含量?！咀⒁馐马?xiàng)】注意要準(zhǔn)確配制所用試劑，準(zhǔn)確量取各溶液?！緦?shí)驗(yàn)報(bào)告】總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并分析評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。三、凱氏定氮法【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)凱氏定氮法的原理和操作技術(shù)?！緦?shí)驗(yàn)原理】凱氏定氮法用于測(cè)定有機(jī)物的含

8、氮量,若蛋白質(zhì)的含氮量已知時(shí)，則可用此法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含量。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與濃硫酸共熱時(shí)，其中的碳、氫兩元素被氧化成二氧化碳和水，而氮?jiǎng)t轉(zhuǎn)變成氨，并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨。此過程通常稱為“消化”。但是，這個(gè)反應(yīng)進(jìn)行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應(yīng)液的沸點(diǎn)，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。消化完成后，在凱氏定氮儀中加入濃堿，可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借助水蒸汽蒸餾法，將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量、一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中氫離子結(jié)合，使溶液中的氫離子濃度降低，指示劑顏色改變，然后用標(biāo)準(zhǔn)無機(jī)鹽酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來的氫離子濃度為止。根據(jù)所用標(biāo)

9、準(zhǔn)鹽酸的量可計(jì)算出待測(cè)物中的總氮量。蛋白質(zhì)的含氮量為16%，即1克蛋白質(zhì)中的氮相當(dāng)于6.25克蛋白質(zhì)，用凱氏定氮法測(cè)出的含氮量乘以6.25,即得樣品中蛋白質(zhì)的含量。【實(shí)驗(yàn)用品】1.實(shí)驗(yàn)器材微量凱氏定氮儀1套；50mL凱氏燒瓶4個(gè)；移液管；錐形瓶；試管；小玻璃珠2.試驗(yàn)試劑(1)濃硫酸；30氫氧化鈉溶液；2硼酸溶液；標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液(0.01molL)。(2) 粉末硫酸鉀硫酸銅混合物：K2SO4與CuSO45H2O以3：1配比研磨混合。(3)混合指示劑(田氏指示劑)：由50mL0.1甲烯藍(lán)乙醇溶液與200mL0.1甲基紅乙醇溶液混合配成，貯于棕色瓶中備用。(4)樣品溶液：配制3mg/mL的牛血清白蛋

10、白溶液作為樣品?！痉椒ú襟E】1.安裝凱氏定氮儀。2.消化：取4個(gè)50ml凱氏燒瓶并標(biāo)號(hào),各加1顆玻璃珠，在1號(hào)及2號(hào)瓶中各加樣品1mL，催化劑(K2SO4CuSO45H2O)200mg，濃硫酸5mL。注意加樣品時(shí)應(yīng)直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶頸上。在3號(hào)及4號(hào)瓶中各加1mL蒸餾水和與1、2號(hào)瓶相同量的催化劑和濃硫酸，作為對(duì)照。在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行消化。在消化開始時(shí)應(yīng)控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明淡綠色為止。撤掉火力，冷卻至室溫。3.蒸餾：(1)蒸餾器的洗滌：用水洗滌干凈微量凱氏定氮儀，在蒸汽發(fā)生器中加入用幾滴硫酸酸化的蒸餾

11、水和幾滴甲基紅指示劑，用這樣的水蒸氣洗滌凱氏定氮儀。約15分鐘后，在冷凝器下端傾斜放好裝有硼酸指示劑的錐形瓶，繼續(xù)蒸汽洗滌 2 分鐘，觀察錐形瓶?jī)?nèi)的溶液是否變色，如不變色則證明蒸餾裝置內(nèi)部已洗滌干凈。移走錐形瓶，停止加熱，打開夾子。(2)蒸餾：取下棒狀玻塞，用吸管吸取消化液，細(xì)心地插到反應(yīng)室小玻璃杯的下方，塞緊棒狀玻塞。將一個(gè)含有硼酸和指示劑的錐形瓶放在冷凝器下方，使冷凝器下端浸沒在液體內(nèi)。取30的氫氧化鈉溶液10ml放入小玻璃杯中， 輕提棒狀玻璃塞使之流入反應(yīng)室(為了防止冷凝管倒吸，液體流入反應(yīng)室必須緩慢)。尚未完全流入時(shí)，將玻璃塞蓋緊，向玻璃杯中加入蒸餾水約 5ml。再輕提玻璃塞，使一半蒸

12、餾水慢慢流入反應(yīng)室，一半留在玻璃杯中作水封。加熱水蒸汽發(fā)生器，沸騰后夾緊夾子，開始蒸餾。氨氣進(jìn)入錐形瓶，瓶中的酸溶液由紫色變成綠色。變色時(shí)起記時(shí)，再蒸餾5分鐘。移動(dòng)錐形瓶，使硼酸液面離開冷凝管約1厘米，并用少量蒸餾水洗滌冷凝管口外面，繼續(xù)蒸餾1分鐘，移開錐形瓶，用表面皿覆蓋錐形瓶。蒸餾完畢后，須將反應(yīng)室洗滌干凈，再繼續(xù)下一個(gè)蒸餾操作。待樣品和對(duì)照均蒸餾完畢后，同時(shí)進(jìn)行滴定。4.滴定：用0.01moLL的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定各錐形瓶中收集的氨量，硼酸指示劑溶液由綠色變淡紫色為滴定終點(diǎn)?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】其中：A 為滴定樣品用去的鹽酸溶液平均mL數(shù)；B 為滴定對(duì)照液用去的鹽酸溶液平均mL數(shù)；C 為所取樣品溶

13、液的mL數(shù)。【注意事項(xiàng)】注意不要讓濃硫酸粘到衣服或皮膚上?！緦?shí)驗(yàn)報(bào)告】總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并分析評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。四、二喹啉甲酸法(BCA法)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆沼肂CA方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和操作方法。【實(shí)驗(yàn)原理】BCA檢測(cè)法是Lowry測(cè)定法的一種改進(jìn)方法。與Lowry方法相比，BCA法的操作更簡(jiǎn)單，試劑更加穩(wěn)定，幾乎沒有干擾物質(zhì)的影響，靈敏度更高（微量檢測(cè)可達(dá)到0.5g/mL），應(yīng)用更加靈活。蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下能與Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物，同時(shí)將Cu2+還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，可以和Cu+結(jié)合生成深紫色的化合物，這種穩(wěn)定的化合物在5

14、62nm處具有強(qiáng)吸收值，并且化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量?！緦?shí)驗(yàn)用品】1.實(shí)驗(yàn)器材分光光度計(jì)；恒溫水浴槽；移液管；微量進(jìn)樣器；試管架和試管。2.實(shí)驗(yàn)試劑(1)BCA試劑的配制試劑A，1L：分別稱取10gBCA(1%)，20gNa2CO3·H2O(2%)，1.6g Na2C4H4O6·2H2O(0.16%)，4gNaOH(0.4%)，9.5gNaHCO3(0.95)，加水至1L，用NaOH或固體NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至11.25。 試劑B，50mL：取2gCuSO4·5H2O(4%)，加蒸餾水至50mL。 BCA試劑：取50

15、份試劑A與1份試劑B混合均勻。此試劑可穩(wěn)定一周。(2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水中并定容至100mL，制成400g/mL的溶液。(3)樣品溶液：配制約50g/mL的牛血清白蛋白溶液作為樣品?！痉椒ú襟E】1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取6支干燥潔凈的大試管，編號(hào)，按下表加入試劑。上述試劑加完后，混勻，于37保溫30min，冷卻至室溫后，以第1管為對(duì)照，在562nm處比色，讀取各管吸光值，以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.樣品測(cè)定準(zhǔn)確吸取250L樣品溶液于一干燥潔凈的試管中，加入BCA試劑5mL，搖勻，于37保溫30min，冷卻至室溫后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線1號(hào)管為

16、對(duì)照，在595nm處比色，記錄吸光值?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】根據(jù)樣品的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的蛋白質(zhì)含量?！咀⒁馐马?xiàng)】1注意微量進(jìn)樣器的用法，試劑用量少，要準(zhǔn)確量??；2. 注意按標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制要求繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?！緦?shí)驗(yàn)報(bào)告】總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并分析評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。五、考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合比色法【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆沼每捡R斯亮藍(lán)染料結(jié)合比色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和操作方法。【實(shí)驗(yàn)原理】考馬斯亮藍(lán)G250是一種染料，在游離狀態(tài)下呈紅色，最大吸收峰在465nm。當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變成深藍(lán)色，最大吸收峰變?yōu)?95nm。蛋白質(zhì)含量在11000g范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)染料復(fù)合物在595nm處的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用比色法測(cè)定

17、。蛋白質(zhì)染料復(fù)合物具有很高的吸光值，因此大大提高了蛋白質(zhì)測(cè)定的靈敏度，最低檢出量為1g蛋白。染料與蛋白質(zhì)結(jié)合迅速，大約為2分鐘，結(jié)合物的顏色在1小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。所以本法操作簡(jiǎn)便，快速，靈敏度高，穩(wěn)定性好，是一種測(cè)定蛋白質(zhì)含量的常用方法。【實(shí)驗(yàn)用品】1.實(shí)驗(yàn)器材分光光度計(jì)；試管；移液管；容量瓶。2.實(shí)驗(yàn)試劑(1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水中并定容至100mL，制成100g/mL的溶液。(2)考馬斯亮藍(lán)G250試劑：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G250，溶于50mL 95乙醇中，加入85%(m/v)的磷酸100mL，最后用蒸餾水定容到1000mL。此溶液可在常溫下放置一個(gè)月。(3)樣品溶液：配制約50g/mL的牛血清白蛋白溶液作為樣品?！痉椒ú襟E】1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取6支干燥潔