限制性內(nèi)切酶結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)聚合酶鏈反應(yīng)定量檢測(cè)在多藥耐藥基因甲基化狀態(tài)中的應(yīng)用

1、限制性內(nèi)切酶結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)聚合酶鏈反應(yīng)定量檢測(cè)在多藥耐藥基因甲基化狀態(tài)中的應(yīng)用生苧旦筮墊鲞筮塑Med,April2005v0l28.N4?4O9?基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)診斷研究.限制性內(nèi)切酶結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)聚合酶鏈反應(yīng)定量檢測(cè)在多藥耐藥基因甲基化狀態(tài)中的應(yīng)用朱燕武淑蘭屈晨雪卜定方因啟動(dòng)子區(qū)含甲基化位點(diǎn)的一102+186bp片段間設(shè)計(jì)1條正義引物和2條反義引物,采用不同的反義引物,經(jīng)3次聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得較目的片段缺失3Obp的競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)DNA片段,以Pbluescriptsk+為載體構(gòu)建競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)DNA質(zhì)粒;待檢基因組DNA經(jīng)甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶Hpa消化后與競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)DNA競(jìng)爭(zhēng)擴(kuò)增MDR1基因;PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖

2、凝膠電泳和凝膠成像分析儀掃描,目的片段量等于反應(yīng)體系中競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)量乘以目的片段與競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)片段的光密度比值,HpaII酶切內(nèi)標(biāo)共擴(kuò)增MDR1基因啟動(dòng)子區(qū)目的片段,兩擴(kuò)增產(chǎn)物量的比值與基因組DNA量呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=0.992,P<0.001.結(jié)論本方法用于MDR1基因甲基化定量檢測(cè),操作相對(duì)簡(jiǎn)單,定量準(zhǔn)確可靠,適用于臨床研究中大量樣本檢測(cè).【關(guān)鍵詞】DNA甲基化;聚合酶鏈反應(yīng);多藥耐藥基因Quantitativedetectionofmethylationstatusinthemulti?drugresistance1genebycompetitivepoIymerasech

3、ainreactioncombinedthrestrictiveendonudeasesZHUYah,刪Shulan,QuChenxll,e,BUOing-fang.DepartmentofHematology,PeJUniversityFirstHospital,Beifing100034,ChinaCorrespondingauthor:WUShu一/an【Abstract】OMectiveToestablishamethodofcompetitivepolymerasechainreactioncombinedOnesenseprimerandtwoanti-senseprimerswe

4、redesignedtoamplifyafragmentofMDR1genepromoterDNAfragment,witchwasless30bpthantargetfragmentwasmadebythreetimesofpolymerasechainreaction(PCR)usingdifferentanti-senseprimerandthensubclonedintothePbluescriptsk+plasmi&,I1legenomicDNAdigestedbyHpa,amethylation-sensitiverestrictiveendonucleaseand

5、competitiveinternalreferenceDNAwerecompetitivelyamplifiedforMDRlpromoterinthesRlnetubebyPCR11lePCRproductswereelectrophoresedonagarosege1.stainedbyethidiumbromideandsubjectedtoimageanalysisscanner.ratioofPCRproductsamplifiedfromHpalIdigestedDNAandundigestedDNAwasnamedthemethylationrate.Results11lege

6、nomicDNAseriallydilutedwithoptimalamountofcompetitiveinternalreferenoDNAandtheamountofgenomieDNAwasdemonstrated.11lecorrelationcoefficientwas0.992.P<analyzeagreatquantitiesofspecimensinclinicalresearch.【Keywords】DNAmethylation;Multi-drugresistancegene;Polymerasechainreaction基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(

7、30070324)作者單位:100034北京大學(xué)第一醫(yī)院血液內(nèi)科(朱燕,武淑蘭),檢驗(yàn)科(屈晨雪),中心實(shí)驗(yàn)室(卜定方)通信作者:武淑蘭DNA甲基化是調(diào)控基因表達(dá)的重要機(jī)制之一.因其與腫瘤發(fā)生,發(fā)展密切相關(guān),已形成研究熱點(diǎn)¨.但是,目前研究甲基化狀態(tài)所用的方法多為競(jìng)爭(zhēng)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)相結(jié)合,建立了一種定量檢測(cè)多藥耐藥基因(MDR1)甲基化的方法,適于臨床應(yīng)用.材料和方法1.競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒的構(gòu)建:在MDR1基因啟動(dòng)子區(qū)含甲基化位點(diǎn)的一102bp+186bp間設(shè)計(jì)1條正義引物(5AGCAGTCATCTGTGGTGAGG3)和2條反義引物(反義引物1:5AAAGCCTGACACTrG

8、GGAAC3和反義引物2:5CACrI1GGGAACCCTACCTCGCGCTCCTrG3),經(jīng)3次PCR擴(kuò)增獲得較目的片段缺失3Obp的競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)DNA片段,與Pbluescriptsk質(zhì)粒連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5ot,所獲質(zhì)粒DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶鑒定.2.限制性內(nèi)切酶結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性PCR技術(shù)的建立:(1)確定競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)的最佳用量:25lPCR反應(yīng)體系中含不同稀釋度的競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)11,正?；蚪MDNA50ng,正義和反義引物1各20pmol,反應(yīng)產(chǎn)物DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的亮度最接近者為最佳競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)濃度.(2)定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性驗(yàn)證:25lPCR反應(yīng)體系中含最佳競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)1,正?；蚪MDNA含量分別為6.25

9、,12.5,25,50,100,200和4o0ng,反應(yīng)產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像分析儀掃描,SPSS11.0分析軟件進(jìn)行直線相關(guān)性分析.(3)限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng):2O體系中含待檢DNA250ng,限制性內(nèi)切酶lOu,每份標(biāo)本設(shè)M,H和0三管,分別加入MspI,HpalI和不加酶,37消化過(guò)內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段的光密度比值M/OO.056(取自lO例正常人骨髓標(biāo)本檢測(cè)平均值)視為酶切完全,>0.056為酶切不完全,應(yīng)重新酶切.(4)競(jìng)爭(zhēng)性PCR及掃描定量:25l反應(yīng)體系中分別加人M,H和0管DNA50ng,聚合酶2U.94oC變性30S,61oC退火30S,72延伸30S,32個(gè)循

10、環(huán)后72延伸7min.反應(yīng)產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像分析儀掃描,按下列公式計(jì)算甲基化率:目的片段(H)=目的片段光密度值/競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)光密度值×10'.目的片段(O)=目的片段光密度值/競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)光密度值×10''.甲基化率=目的片段(H)/目的片段(O)×100%.結(jié)果1.競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)DNA質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果:競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)DNA質(zhì)粒經(jīng)BamHI和Hind11I酶切后獲得預(yù)期的3kb(載體)及258bp(內(nèi)標(biāo)).2.最佳競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)模板量:基因組DNA50ng與不同稀釋度競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)DNA共擴(kuò)增后,瓊脂糖凝膠電泳顯示以競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)濃度為1O-6時(shí)基因組DNA與競(jìng)

11、爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增條帶的亮度最相近(圖1),故以10-¨一組DNA中可擴(kuò)增的目的產(chǎn)物量減少,競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)量也相應(yīng)減少以獲得最佳擴(kuò)增效果,故M管和H管中最佳競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)量定為10一1.bpMaC1101010-10-.lO-'288258Ma:pBR322/HaeIII;C:空白對(duì)照;不同濃度競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)與5OIlg基因組DNA共擴(kuò)增圖1確定0管最佳競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)量的凝膠電泳圖標(biāo)共擴(kuò)增:目的片段與競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)片段的光密度比值隨基因組DNA用量的增加而增加(圖2),兩者比值與基因組DNA進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.992,P<O.001(圖3).MaC6.2512.52550

12、100200400bp288258Ma:pBR322/HaeR;C:空白對(duì)照;倍比稀釋量基因組DNA與最佳量競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)DNA共擴(kuò)增圖2PCR產(chǎn)物量與模板DNA量的關(guān)系4.MDR1基因甲基化的定量檢測(cè):一例待檢標(biāo)本甲基化定量檢測(cè)的凝膠電泳及計(jì)算結(jié)果見圖4.討論廣泛用于DNA甲基化研究的經(jīng)典方法是基于甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶結(jié)合Southern印跡技術(shù)或PCR技術(shù)引,但有繁瑣耗時(shí),同位素污染,標(biāo)本用量大等缺點(diǎn);基于亞硫酸鹽修飾技術(shù)的甲基化生旦筮鲞筮翅,April2005.v0l28.N.4PCR產(chǎn)物比值=目的片段光密度值/競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)片段光密圖3基因組DNA量與PCR產(chǎn)物比值的相關(guān)性309242MItC

13、MMa:pBR322/MspImarker;C:空白對(duì)照;M:MspI酶切標(biāo)本,無(wú)目的片段,示酶切完全;H:HpalI酶切標(biāo)本,目的片段(H)=77/168××10_.O:未酶切標(biāo)本,目的片段(0)=210/201××10_.甲基化率=目的片段(H)/目的片段(0)×100%=4.4%圖41例待檢標(biāo)本MDR1基因甲基化的定量檢測(cè)特異性聚合酶鏈反應(yīng)及測(cè)序.5雖然特異,敏感,但檢測(cè)了31例急性白血病患者mdrl基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài),所采用的方法是將酶切后基因組DNA進(jìn)行倍比稀釋后行PCR反應(yīng),使反應(yīng)控制于指數(shù)期,從而能夠較準(zhǔn)確定量,但這種方法P

14、CR條件難以控制,操作繁瑣,且需要較大的樣本量.本研究建立的定量檢測(cè)MDR1基因甲基化水平的方法中有兩個(gè)關(guān)鍵的技術(shù)問(wèn)題.第一,競(jìng)爭(zhēng)性PCR技術(shù)的關(guān)鍵是構(gòu)建競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo),通常是采用定點(diǎn)究設(shè)計(jì)了1條正義引物和2條反義引物,其中反義引物2的5端與反義引物1的3端有11bp片段序列相同,使經(jīng)過(guò)3次PCR擴(kuò)增后,在第3次PCR產(chǎn)物的中央有30bp的缺失,其余序列則與PCR擴(kuò)增導(dǎo)入缺失突變的方法來(lái)建立競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo),操作相對(duì)簡(jiǎn)究的內(nèi)標(biāo)構(gòu)建中試用.第二,限制性內(nèi)切酶消化不完全是難以避免的技術(shù)問(wèn)題,對(duì)判斷甲基化程度影同裂酶,均識(shí)別CCGG序列,但MspI的酶切作用不受該位點(diǎn)甲基化的影響,而當(dāng)識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生甲基化時(shí),甲基化

15、敏感的口lI不再能識(shí)別該位點(diǎn).因此,本研究將MspI消化標(biāo)本管(M管)設(shè)置為實(shí)驗(yàn)外參照,并經(jīng)10例正常人標(biāo)本檢測(cè)后,將M管與0管比值0.056作為消化是否完全的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn),避免了受檢標(biāo)本因酶切反應(yīng)不完全出現(xiàn)假陽(yáng)性的可能.為檢驗(yàn)競(jìng)爭(zhēng)性PCR技術(shù)定量的可靠性,將倍比稀釋量的基因組DNA與固定量的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)共擴(kuò)增,目的片段/競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)片段的光密度比值與基因組DNA進(jìn)行相關(guān)性分析顯示呈顯著正相關(guān),這提示用這種方法定量是準(zhǔn)確可靠的.采用本設(shè)計(jì)的方案,我們同樣建立了定量檢測(cè)MDR1基因啟動(dòng)子區(qū)另一個(gè)位點(diǎn)甲基化水平的方法,均成功地用于63例血液腫瘤患者M(jìn)DR1基因甲基化與表達(dá)的相關(guān)性研究(另文報(bào)道),結(jié)果證明,

16、只要確定好固定反應(yīng)條件下的最佳競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)用量,嚴(yán)格限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)的質(zhì)量控制,該法對(duì)甲基化水平的定量研究是準(zhǔn)確可信的,且操作相對(duì)簡(jiǎn)單,適用于臨床研究中的化狀態(tài)的定量檢測(cè).參考文獻(xiàn)Surv,1996,28:87-92.2KusabaH,NakayamaM,HaradaT,eta1.Associationof5'CpGdemethylationandalteredchromatinstructureinthepromoterregi0nwithtranscriptionalactivationofthemultidrugresistance1geneinhumancancerceHs.EurJBioehem,l99l9,262:924-93