小動物活體成像技術(shù)的原理及操作方法

1、活體動物體內(nèi)光學(xué)成像主要采用生物發(fā)光與熒光兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶基因(Luciferase )標記細胞或DNA而熒光技術(shù)則采用綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白等熒光報告基因和FITC、Cy5、Cy7等熒光素及量子點(quantumdot , QD世行標記。小動物活體成像技術(shù)是采用高靈敏度制冷 CCD®合特制的成像暗箱和圖像處理軟件， 使得可以直接監(jiān)控 活體生物體內(nèi)的細胞活動和基因行為。 實驗者借此可以觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達等生物學(xué)過程。由于具有更高量子效率 CCD的問世，使活體動物體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)具有越來越高的靈敏度，對腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的

2、檢測靈敏度極高；另外，該技術(shù)不涉及放射性物質(zhì)和方法，非常安全。因其操作極其簡單、所 得結(jié)果直觀、靈敏度高、實驗成本低等特點，在剛剛發(fā)展起來的幾年時間內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、 醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面。一、小動物活體成像概述1 .熒光發(fā)光成像熒光成像的標記對象較為廣泛，可以是動物、細胞、微生物、基因，也可以是抗體、藥物、納米材料等。常用的有綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(DsRed)及其它熒光報告基團，標記方法與體外熒光成像相似，熒光成像具有費用低廉和操作簡單等優(yōu)點。同生物發(fā)光在動物體內(nèi)的穿透性相似，紅光的穿透性 在體內(nèi)比藍綠光的穿透性效率高，近紅外熒光為成像觀察的最佳選擇。雖然熒光信號

3、遠遠強于生物發(fā)光，但非特異性熒光產(chǎn)生的背景噪音使其信噪比遠遠低于生物發(fā)光。雖然許多公司采用不同的技術(shù)分離背景光，但是受到熒光特性的限制，很難完全消除背景噪音。這些背景噪 音造成熒光成像的靈敏度較低。盡管目前大部分高水平的文章還是應(yīng)用生物發(fā)光的方法來研究活體動物體內(nèi)成像。但是，熒光成像有其方便，直觀，標記靶點多樣和易于被大多數(shù)研究人員接受的優(yōu)點，在一些植物分子生物學(xué)研究和觀察小 分子體內(nèi)代謝方面也得到應(yīng)用。對于不同的研究，可根據(jù)兩者的特點以及實驗要求，選擇合適的方法。例如利用綠色熒光蛋白和熒光素酶對細胞或動物進行雙重標記，用成熟的熒光成像技術(shù)進行體外檢測，進行分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)研究，然后利用

4、生物發(fā)光技術(shù)進行動物體內(nèi)檢測，進行活體動物體內(nèi)研究。熒光發(fā)光是通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團到達高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光?？紤]到不同熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜EX (excitation spectrum )和激發(fā)光譜 EM (emission 8pectrum )的不同，要選擇對應(yīng)的激發(fā)和發(fā)射濾片。常用熒光蛋白和熒光染料的激發(fā)和發(fā)射波長見表1。EX(mm)EM(mm表1常用熒光蛋白和熒光染料的激發(fā)和發(fā)射波長dsRed/RFP530600Cy5630680630700Cy77007802 .生物發(fā)光成像活體生物熒光成像技術(shù)是指在小的哺乳動物體內(nèi)利用報告基因-熒光素酶基因表達所產(chǎn)生的熒光素酶蛋白與其小分子底物

5、熒光素在氧、Mg2+離子存在的條件下消耗 ATP發(fā)生氧化反應(yīng)，將部分化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姽饽茚尫?。然后在體外利用敏感的CC血備形成圖像。熒光素酶基因可以被插入多種基因的啟動子，成為某種基因的報告基因，通過監(jiān)測報告基因從而實現(xiàn)對目標基因的監(jiān)測。生物熒光實質(zhì)是一種化學(xué)熒光，螢火蟲熒光素酶在氧化其特有底物熒光素的過程中可以釋放波長廣泛的 可見光光子，其平均波長為560 nm(460 630 nm),這其中包括重要的波長超過 600 nm的紅光成分。在 哺乳動物體內(nèi)血紅蛋白是吸收可見光的主要成分，能吸收中藍綠光波段的大部分可見光；水和脂質(zhì)主要吸收紅外線，但其均對波長為 590 800 nm的紅光至近紅外線

6、吸收能力較差，因此波長超過600 nm的紅光雖然有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳動物組織被高靈敏的CC求測到。生物發(fā)光成像的優(yōu)點可以非侵入性，實時連續(xù)動態(tài)監(jiān)測體內(nèi)的各種生物學(xué)過程，從而可以減少實驗動物數(shù)量，及降低個體間差異的影響；由于背景噪聲低，所以具有較高的敏感性；不需要外源性激發(fā)光，避 免對體內(nèi)正常細胞造成損傷，有利于長期觀察；此外還有無放射性等其他優(yōu)點。然而生物發(fā)光也有自身的不足之處：例如波長依賴性的組織穿透能力，光在哺乳動物組織內(nèi)傳播時會被散射和吸收，光子遇到細胞膜和細胞質(zhì)時會發(fā)生折射，而且不同類型的細胞和組織吸收光子的特性也不盡相同，其中血紅蛋白是吸收光子的主要物質(zhì)；由于是在體外檢

7、測體內(nèi)發(fā)出的信號，因而受到體內(nèi)發(fā)光 源位置及深度影響；另外還需要外源性提供各種熒光素酶的底物，且底物在體內(nèi)的分布與藥動力學(xué)也會影響信號的產(chǎn)生；由于熒光素酶催化的生化反應(yīng)需要氧氣、鎂離子及ATP等物質(zhì)的參與，受到體內(nèi)環(huán)境狀態(tài)的影響。二、小動物活體成像1 .制作動物模型可根據(jù)實驗需要通過尾靜脈注射、皮下移植、原位移植等方法接種已標記的細胞或組織。在建模時應(yīng)認真考慮實驗?zāi)康暮瓦x擇熒光標記，如標記熒光波長短，則穿透效率不高，建模時不宜接種深部臟器和觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)移，但可以觀察皮下瘤和解剖后臟器直接成像。深部臟器和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的觀察大多選用熒光素酶標記。2 .活體成像小鼠經(jīng)過常規(guī)麻醉（氣麻、針麻皆可）后放入成像

8、暗箱平臺，軟件控制平臺的升降到一個合適的視野，自動開啟照明燈（明場）拍攝第一次背景圖。下一步，自動關(guān)閉照明燈，在沒有外界光源的條件下（暗場）拍攝由小鼠體內(nèi)發(fā)出的特異光子。明場與暗場的背景圖疊加后可以直觀的顯示動物體內(nèi)特異光子的部位和強度，完成成像操作。值得注意的是熒光成像應(yīng)選擇合適的激發(fā)和發(fā)射濾片，生物發(fā)光則需要成像前體內(nèi)注射底物激發(fā)發(fā)光。3 .數(shù)據(jù)處理小動物活體成像圖像處理軟件除了提供含有光子強度標尺的成像圖片外，還能計算分析發(fā)光面積、總光子數(shù)、光子強度的相關(guān)參數(shù)供實驗者參考。4 .實驗影響因素原則上，如預(yù)實驗時拍攝出圖片非特異性雜點多，需降低曝光時間；反之，如信號過弱可適當延長曝光 時間。

9、但曝光時間的延長，不僅增加了目的信號，對于背景噪音也存在一個放大效應(yīng)。同一批實驗應(yīng)保 持一致的曝光時間，同時還應(yīng)保持標本相對位置和形態(tài)的一致，從而減少實驗誤差。進行熒光成像時，實驗者可選擇背景熒光低不容易反光的黑紙放在動物標本身下，減少金屬載物臺的反射干擾。動物體內(nèi)很多物質(zhì)在受到激發(fā)光激發(fā)后，會發(fā)出熒光，產(chǎn)生的非特異性熒光會影響到檢測靈敏度。背景熒光主要是來源于皮毛和血液的自發(fā)熒光，皮毛中的黑色素是皮毛中主要的自發(fā)熒光源，其發(fā)光光線波長峰值在500 520 nm左右，在利用綠色熒光作為成像對象時，影響最為嚴重，產(chǎn)生的非特異性熒光會影響到檢測靈敏度和特異性。動物尿液或其他雜質(zhì)如沒有及時清除，成像中也會出現(xiàn)非特異性信號。由于各廠商的圖像分析軟件不同，實驗數(shù)據(jù)分析方法也有區(qū)別。活體成像系統(tǒng)使用時，實驗者考慮到非 特異性雜信號，以及成像圖片美觀等方面，可能會調(diào)節(jié)信號的閾值，因此在分析信號光子數(shù)或信號面積 時，應(yīng)考慮閾值的改變對實驗結(jié)果的影響。正確選擇 ROI區(qū)域，可提高分析實驗數(shù)據(jù)的準確性。三、展望小動物活體成像技術(shù)具有靈敏度高、直觀、操作簡單、能同時觀測多個實驗標本，相比