生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)操練習(xí)總結(jié)報(bào)告

1、生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)操練習(xí)總結(jié)報(bào)告專業(yè)：生物工程 班級(jí)：2013級(jí)7班 組員：姜慧慧 2013203485王振 2013203491 陳汝斌 2013203496 米棟 2013203500王棟 2013203505 孫傳磊 2013203506第一部分 實(shí)驗(yàn)玻璃器皿與常用工具的準(zhǔn)備與設(shè)備調(diào)試一、玻璃器皿與常用工具：大號(hào)鑷子、尖頭鑷子、剪刀、解剖刀柄、解剖刀片、酒精燈、噴霧器、燒杯（50 mL、100 mL、500 mL、1000 mL）、量筒（1000 mL、100 mL、25 mL）、容量瓶(1000 mL、500 mL、100 mL)、試劑瓶（1000 mL、500 mL、100 mL)、載

2、玻片、蓋玻片、移液管、玻璃棒、藥匙，PH試紙，錐形瓶，稱量紙等。1、玻璃器皿的洗滌：一般玻璃器皿只要保證潔凈即可，可用自來水洗凈，再用普通蒸餾水沖洗，然后晾干即可。組織培養(yǎng)所用器皿和工具必須無菌，因此除正常洗凈外，還須進(jìn)行高壓滅菌。載玻片、蓋玻片的洗滌須用10%的鹽酸酒精溶液浸泡后，再用95%酒精洗滌，然后用綢布擦干備用。須注意不可用其他布或紙張擦拭，以免次生污染。擦拭蓋玻片要按課堂講述的要領(lǐng)進(jìn)行，以免受傷。2、常用玻璃器皿與常用工具的消毒培養(yǎng)瓶的滅菌待培養(yǎng)基配制完成進(jìn)行適當(dāng)分裝然后封口后放入高壓滅菌器中滅菌。各種鑷子、剪刀、解剖刀柄、解剖刀片以及進(jìn)行無菌切割等操作的墊紙、培養(yǎng)皿等須用報(bào)紙包裹

3、，外面再用耐熱和塑料薄膜包裹后放入高壓滅菌器中滅菌。3、高壓滅菌器的使用A檢查電路與設(shè)備完好。B打開滅菌鍋蓋，檢查水量，如水量不足則須向鍋內(nèi)加入適量水。C將待滅菌的物品放入鍋內(nèi)，不要放的太多，以免影響滅菌效果。物品不要近靠鍋壁，以免冷凝水順壁流入物品中。裝有液體的容器要注意不能傾斜、倒置。D加蓋旋緊螺旋。四個(gè)螺栓應(yīng)按對(duì)角順序擰緊。E打開放汽閥，然后打開電源加熱，設(shè)定工作溫度和壓力、工作時(shí)間，一般設(shè)定為溫度120，消毒20min.自開始產(chǎn)生蒸汽后5 min，此時(shí)鍋內(nèi)的冷空氣已由排氣孔排盡，再關(guān)緊放汽閥，讓溫度隨蒸汽壓力的增高而上升。待壓力逐漸上升到所需壓力時(shí)（一般為15磅/時(shí)， 1.034

4、15;105 Pa）, 滅菌20 min。F達(dá)到滅菌時(shí)間后，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)關(guān)閉，此時(shí)切記不可打開滅菌器，要讓系統(tǒng)自行冷卻，待壓力降至0時(shí)，開蓋，取出滅菌物品。G 培養(yǎng)瓶取出后整齊擺放在平坦桌面上冷卻，在培養(yǎng)基凝固前不可使其晃動(dòng)。其他工具與器皿放入超凈工作臺(tái)中備用。4、超凈工作臺(tái)的消毒與使用(1)操作者需穿著隔離衣，帶好一次性口罩、帽子及醫(yī)用乳膠手套。將一應(yīng)需用物品有序地放入超凈工作臺(tái)。包括培養(yǎng)瓶、酒精燈、各種工具、消毒酒精瓶、消毒酒精棉球、廢水杯等。(2) 超凈工作臺(tái)進(jìn)行表面滅菌：先開啟超凈工作臺(tái)上的紫外燈，紫外照射20 min以上。關(guān)閉紫外燈，使用前再用75%的酒精或0.5%過氧乙酸噴灑擦拭消毒

5、工作臺(tái)面，并對(duì)操作者手及前臂用棉球進(jìn)行擦拭消毒。(3)開啟超凈工作臺(tái)工作電源，按照無菌操作規(guī)程操作。(4) 如遇機(jī)組發(fā)生故障，應(yīng)立即通知實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，由專業(yè)人員檢修合格后繼續(xù)使用。(5) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用消毒液擦拭工作臺(tái)面，關(guān)閉工作電源，重新開啟紫外燈照射15 min5、電子天平、電爐、光照培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱等的使用與注意事項(xiàng)（略）。6、旋轉(zhuǎn)切片機(jī)的使用第二部分 常用試劑的配制及玻璃器皿的使用一、常用試劑：硫酸重鉻酸鉀清潔液、10%鹽酸酒精洗液、30%-95%梯度酒精溶液、二甲苯酒精溶液（1:2、1:1、2:1）、石蠟二甲苯飽和溶液、粘片劑、蘇木精染色劑、鐵礬媒染劑、1%銨水溶液、45%冰醋酸、1

6、%蕃紅水溶液、1%固綠酒精(95%)溶液、加拿大樹膠封片劑、卡諾固定液、Ms培養(yǎng)基大量元素、微量元素、有機(jī)物溶液、鐵鹽及植物激素母液、1%升汞消毒劑。二、各種化學(xué)試劑的配制按課程講解的注意事項(xiàng)進(jìn)行。三、培養(yǎng)基的制備1、培養(yǎng)基的主要成分：（1）水（2）無機(jī)成分：無機(jī)大量元素： 氮： 銨態(tài)氮、硝態(tài)氮混合 磷： 磷酸鹽 鉀： 鉀鹽 鈣、硫、鎂無機(jī)微量元素： 鐵、硼、錳、鋅、銅、鉬、鈷、氯（3） 有機(jī)成分： 糖、 維生素、肌醇、氨基酸及有機(jī)附加物。（4）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)： 生長素類： NAA、IAA、IBA、2,4-D 細(xì)胞分裂素類 ： BAP, KT，TDz，ZT 其他類： GA3, ABA， PP

7、333（5）瓊脂2、培養(yǎng)基的制備MS培養(yǎng)基配方母液及取用量成分1升儲(chǔ)備液用量(mg)每升培養(yǎng)基取用量( mL)20*儲(chǔ)備液1（大量元素）NH4NO3KNO3CaCl22H2OMgSO47H2OKH2PO43300038000880074003400 100200*儲(chǔ)備液2（微量元素）KIH3BO3MnSO44H2OZnSO47H2ONa2MoO42H2OCuSO45H2OCoCl26H2O166124044601720505510 1 200*儲(chǔ)備液3（鐵鹽）FeSO47H2ONa2EDTA2H2O55607460 10200*儲(chǔ)備液4（有機(jī)成分）肌醇煙酸鹽酸吡哆醇鹽酸硫胺素甘氨酸200001

8、0010020400 10鐵鹽：7.45gNa2-EDTA(乙二銨四乙酸二鈉)和5.57g FeSO4.7H2O溶于1L水中，配1L培養(yǎng)基時(shí)取此液5 mL大量元素：將藥品稱取后分別溶解再依順序混合定溶，配成10倍濃度的母液，每配制1L培養(yǎng)基時(shí)取母液100 mL微量元素：微量元素用量少，為稱取方便精確，常配成100倍或1000倍的母液，每配制1L培養(yǎng)基時(shí)取母液10 mL或1 mL有機(jī)化合物：可配成100倍或1000倍的母液每配制1L培養(yǎng)基時(shí)取母液10 mL或1 mL激素的配制植物激素：配制成0.1-0.5 mg· mL-1的溶液。萘乙酸（NNA）可溶于熱水中或先溶于少量95酒精中再加水

9、至一定濃度吲哚丁酸（IBA）可先用少量0.4的NaOH溶液溶解，再加水到一定濃度吲哚乙酸（IAA）可先溶于少量95酒精中，再加水到一定濃度細(xì)胞分裂素：6-芐基嘌呤（6-BA）、激動(dòng)素（KT）需用3.65的HCI或0.4 NaOH溶液先溶解后再加水到一定濃度3、培養(yǎng)基的配依次吸取大量元素、微量元素、有機(jī)物母液適量混合 300 mL水中放入瓊脂7g加強(qiáng)完全溶化加入蔗糖30g攪拌使充分溶解注入混合液 攪拌均勻 用0.4的NaOH或3.65的HCl調(diào)節(jié)pH(5.7) 分裝于三角瓶等培養(yǎng)容器內(nèi)，用錫箔紙等將容器口封緊包好 放入高壓鍋中滅菌(1.1Kg/cm2壓力,滅菌1520min) 取出冷卻凝固備用。

10、冷卻后放到培養(yǎng)室預(yù)培養(yǎng)3天，觀察有沒有雜菌污染 4、培養(yǎng)基中激素的添加(1)生長激素2,4-D(1 mg L-1) ： 準(zhǔn)確稱取2,4-D 20mg,用2 mL 95乙醇溶解，然后加水定容到20 mL。(2)細(xì)胞分裂素6-BA(1 mg L-1) ：準(zhǔn)確稱取6-BA 20 mg,用2 mL的1 mol L-1的NaOH溶解, 然后加水到20 mL。(3)NAA: 準(zhǔn)確稱取10mg,用少量1 mol L-1 NaOH溶解后加蒸餾水定容至100 mL,即配制成0.1 mg mL-1的NAA母液。用同樣方法配制6BA母液，濃度為2 mg mL-1。轉(zhuǎn)入細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱，放大倍數(shù)，

11、配制日期，配制人，并置于冰箱中保存?zhèn)溆?。?）各種培養(yǎng)基的激素配比愈傷組織及芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基： MSNAA 0.12.0 mgL-1（單位下同）6-BA 0.5； MSNAA 0.12.06-BA 0.5； MSNAA 0.12.06-BA 1.0；生根培養(yǎng)基: MSNAA 0.51.0； MSNAA 0.12.0； MSNAA 0.12.06-BA 0.05； MSNAA 0.12.06-BA 0.1； 1/2MSNAA 0.12.0； 1/2MSNAA 0.12.06-BA 0.05； 1/2MSNAA 0.12.06-BA 0.1。第三部分 菊花莖的組織培養(yǎng)一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆漳敢旱呐渲煤捅４娣?/p>

12、法，配置培養(yǎng)基以及掌握培養(yǎng)基滅菌的方法，掌握無菌操作技術(shù)，掌握生物無菌培養(yǎng)技術(shù)和知識(shí)。二 實(shí)驗(yàn)原理植物組織培養(yǎng)是把植物的器官,組織以至單個(gè)細(xì)胞,應(yīng)用無菌操作使其在人工條件下,能夠繼續(xù)生長,甚至分化發(fā)育成一完整植株的過程.植物的組織在培養(yǎng)條件下,原來已經(jīng)分化停止生長的細(xì)胞,又能重新分裂,形成沒有組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán),即愈傷組織.這一過程稱為“脫分化作用”,已經(jīng)“脫分化”的愈傷組織,在一定條件下,又能重新分化形成輸導(dǎo)系統(tǒng)以及根和芽等組織和器官,這一過程稱“再分化作用”.植物激素在此過程中起著重要的作用,吲哚乙酸（ IAA ）和 6 芐基氨基腺嘌呤（ 6 BA ）的比例,決定了根和芽的分化. 

13、三 實(shí)驗(yàn)器材（一）試劑  乙醇、IAA 或 2 , 4 D 、HgCl 2 （或次氯酸鈉）、6- 芐基氨基腺嘌呤（ 6-BA ） MS 培養(yǎng)基（二）儀器設(shè)備 培養(yǎng)室,高壓滅菌鍋,水浴鍋,解剖刀,三角燒瓶（ 100mL ）,燒杯,量筒,培養(yǎng)皿,超凈工作臺(tái),分析天平,長鑷子,剪刀,橡皮筋等四 、實(shí)驗(yàn)步驟1. 配制培養(yǎng)基（ 1 ）愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基： MS 培養(yǎng)基（蔗糖含量為 10 g/L , 2,4 D 含量為 2 mg/L ,瓊脂 10 g/L ）. （ 2 ）試驗(yàn)培養(yǎng)基：在 MS 培養(yǎng)基中按表 33 1 加入 IAA 和 6BA . 吲哚乙酸先用少量 0

14、.1 mol/L NaOH 溶解, 6- 芐基氨基腺嘌呤先用少量 0.1 mol/L HCl 溶解,然后用蒸餾水稀釋,再加入培養(yǎng)基中. 2. 培養(yǎng)基滅菌 將配好的培養(yǎng)基加入瓊脂加熱溶解,調(diào)至 pH 5.8 ,趁熱分裝于 100 mL 三角燒瓶中,每瓶約 20 mL .待培養(yǎng)基冷卻凝固后,用兩層稱量紙包扎瓶口,并用橡皮筋扎牢,然后在高壓滅菌鍋中 121 （ 1 kg/cm 2 ）下滅菌 20 min .取出三角燒瓶放在臺(tái)子上,冷卻后備用.接種操作所需的一切用具（如長鑷子、解剖刀、剪刀等）及滅菌水,需同時(shí)滅菌.3. 誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織  （ 1 ）取健壯的菊花莖數(shù)段,每

15、段約 5 cm 長,于燒杯中用 0.1% 氯化汞（升汞）浸泡 20 min ,取出用無菌水洗 3 4 次,置于無菌培養(yǎng)皿中,在接種箱中按無菌操作要求剝?nèi)ネ馄ぃń臃N箱事先用紫外燈滅菌 30 min ）,用解剖刀切成 5 mm 厚的圓片（棄去開始一片和最后一片）,用長鑷子將它接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,注意圓片的切口朝向培養(yǎng)基,每瓶接種 4 片,接種后扎好瓶口.  （ 2 ）將已接入植物組織（外植體）的三角燒瓶,培養(yǎng)在 25 溫室中,每星期檢查 l 2 次,剔除材料已被雜菌污染的三角燒瓶, 3 4 周后產(chǎn)生愈傷組織. （ 3 ）選取愈傷組織生長良好的三角燒瓶,用解剖刀將愈傷組織切下,轉(zhuǎn)移到含有不

16、同激素的試驗(yàn)培養(yǎng)基中（也可以連同原來的外植體一起轉(zhuǎn)移）,每瓶放 1 2 塊,仍培養(yǎng)在 25 溫室中,每周 1 2 次觀察不同處理的三角燒瓶中,愈傷組織分化情況,直至長出根和芽.長成的幼小植株即為“試管苗”,可移栽于花盆中.五 、實(shí)驗(yàn)結(jié)果因?yàn)闀r(shí)間有限及實(shí)驗(yàn)嚴(yán)密性等問題,大部分都失敗了,但是仍然有小部分分化發(fā)育了出來.已經(jīng)證明了植物組織能夠經(jīng)過脫分化作用,形成愈傷組織,經(jīng)過再分化作用,愈傷組織又能重新分化為有結(jié)構(gòu)的組織和器官,最終形成完整的植株.六、 注意事項(xiàng)1、培養(yǎng)材料的選擇，需要選擇生長較好的材料2、植物材料的滅菌，要根據(jù)不同的材料來確定，材料允許的話，可以設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)取得最佳的滅菌處理3、培養(yǎng)基

17、的配置。要根據(jù)不同的材料，不同的物種，選擇合適的培養(yǎng)基，最好有一組實(shí)驗(yàn)取得。做培養(yǎng)基的過程中注意調(diào)劑培養(yǎng)基的PH值，有些高溫分解的激素要過濾滅菌等。4、培養(yǎng)條件的選擇，包括光照、溫度、濕度等。5、接種。注意滅菌，最好有超凈工作臺(tái)。第四部分 洋蔥植物根尖染色體制片及觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握洋蔥根尖制片的方法，復(fù)習(xí)染色、壓片的基本操作。2、觀察植物細(xì)胞有絲分裂過程及各個(gè)時(shí)期的染色體行為。二、實(shí)驗(yàn)原理1.植物根尖分生組織的細(xì)胞有絲分裂比較旺盛，每天都有分裂高峰時(shí)期。 2.不同植物分裂高峰時(shí)期是不同的。大蒜和洋蔥細(xì)胞的有絲分裂高峰時(shí)期通常在上午九點(diǎn)到十一點(diǎn)。 3.把分裂時(shí)期的根尖用固定液固定，再經(jīng)染色

18、后壓片，在顯微鏡下進(jìn)行觀察，就能看到處于有絲分裂各時(shí)期的細(xì)胞和染色體。 4.預(yù)處理可以使染色體縮短變粗，易于計(jì)數(shù)。同時(shí)抑制細(xì)胞分裂過程中紡錘絲的形成，使更多細(xì)胞停留在分裂中期。這時(shí)，染色體分散在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中，有利于染色體的形態(tài)數(shù)目觀察。三、材料與方法1.取材洋蔥（Aillum cepa）的鱗莖2.實(shí)驗(yàn)器具和藥品2.1器具a.載玻片 b.蓋玻片 c.燒杯 d.量筒 e.培養(yǎng)皿 f.濾紙 g.玻璃棒 h.鑷子 i.手術(shù)刀2.2藥品a.0.1mol/L醋酸鈉溶液 b.0.25%秋水仙素 c.冰醋酸 d.無水乙醇 e.1mol/LHcl f.纖維素酶 g.果膠酶 h.卡寶品紅2.3試劑配制卡諾固定液：

19、用3份無水酒精，加入1份冰醋酸（現(xiàn)配現(xiàn)用）。 酸解液：一份無水乙醇與一份1mol/L 鹽酸1:1進(jìn)行配制。酶解液：用0.4g的纖維素酶和0.15g的果膠酶溶解在20ml蒸餾水里。配制成20ml酶解液。3.實(shí)驗(yàn)步驟 3.1取材將洋蔥的鱗莖，置于盛水的小塑料杯上培養(yǎng)。注意選取的洋蔥要充實(shí)而飽滿，表面要油光發(fā)亮，底部鱗片薄的老洋蔥，去掉老根但不要傷害根芽，用刀片適當(dāng)削去根部的木栓組織，置于清水中培養(yǎng)，最好使用宿舍放溫了的開水，（水的高度要求與洋蔥底部正好接觸）并且需要注意勤換水，防止根腐爛。3.2預(yù)處理將洋蔥根尖浸泡到0.25%的秋水仙素溶液中2小時(shí)。3.3固定將預(yù)處理過的根部切下，浸泡在配好的卡諾

20、固定液中2.5小時(shí)。3.4解離1）酸解：從固定液中取出洋蔥根尖，用蒸餾水漂洗，再放到解離液，在60水浴中解離。（時(shí)間為610min）2）酶解：從固定液中取出洋蔥根尖，放在0.1mol/L 醋酸鈉中漂洗。然后放入配好的溶液中，在28溫箱中解離1小時(shí)。3.5壓片取出根尖，酸解后的根尖用蒸餾水漂洗，酶解后的根尖用0.1mol/L 醋酸鈉漂洗，將根尖滴加卡寶品紅染液，等待515分鐘。蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去多余染液。用鑷尖輕輕敲打蓋玻片，使細(xì)胞鋪成薄薄一層。然后用顯微鏡觀察。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果方案1：酸解：10min分析：解離時(shí)間較短，使解離不完全，細(xì)胞不能很好的分散開來。并且細(xì)胞壁未被破壞，導(dǎo)致染色液無法進(jìn)入細(xì)胞，染色體無法被染色。解決方案：延長酸解時(shí)間。方案2：酸解、酶：10min分析：細(xì)胞分裂全處于間期。1：根尖細(xì)胞