三代測序原理技術(shù)比較

1、三代測序技術(shù)和原理介紹 導(dǎo)讀從1977年第一代DNA測序技術(shù)（Sanger法）1，發(fā)展至今三十多年時間，測序技術(shù)已取得了相當(dāng)大的發(fā)展，從第一代到第三代乃至第四代，測序讀長從長到短，再從短到長。摘要：從1977年第一代DNA測序技術(shù)（Sanger法）1， 發(fā)展至今三十多年時間，測序技術(shù)已取得了相當(dāng)大的發(fā)展，從第一代到第三代乃至第四代，測序讀長從長到短，再從短到長。雖然就當(dāng)前形勢看來第二代短讀長測序 技術(shù)在全球測序市場上仍然占有著絕對的優(yōu)勢位置，但第三和第四代測序技術(shù)也已在這一兩年的時間中快速發(fā)展著。測序技術(shù)的每一次變革，也都對基因組研究，疾 病醫(yī)療研究，藥物研發(fā)，育種等領(lǐng)域產(chǎn)生巨大的推

2、動作用。在這里我主要對當(dāng)前的測序技術(shù)以及它們的測序原理做一個簡單的小結(jié)。 圖1：測序技術(shù)的發(fā)展歷程 生命體遺傳信息的快速獲得對于生命科學(xué)的研究有著十分重要的意義。以上（圖1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以來，整個測序技術(shù)的發(fā)展歷程。 第一代測序技術(shù) 第一代DNA測序技術(shù)用的是1975年由桑格（Sanger）和考爾森 （Coulson）開創(chuàng)的鏈終止法或者是1976-1977年由馬克西姆（Maxam）和吉爾伯特（Gilbert）發(fā)明的化學(xué)法（鏈降解）. 并在1977年，桑格測定了第一個基因組序列，是噬菌體X174的，全長5375個堿基1。 自此，人類獲得了窺探生命遺傳差

3、異本質(zhì)的能力，并以此為開端步入基因組學(xué)時代。研究人員在Sanger法的多年實踐之中不斷對其進行改進。在2001年， 完成的首個人類基因組圖譜就是以改進了的Sanger法為其測序基礎(chǔ)，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2和3都不含羥基，其在DNA的合 成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應(yīng)，在4個DNA合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的ddNTP（分 為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列（圖2）。這個網(wǎng)址為 sanger測序法制作了一個小短片，形象而生動。 值得注

4、意的是，就在測序技術(shù)起步發(fā)展的這一時期中，除了Sanger法之外還出現(xiàn)了一些其他的測序技術(shù)，如焦磷酸測序法、鏈接酶法等。其中，焦磷酸測序法是后來Roche公司454技術(shù)所使用的測序方法24，而連接酶測序法是后來ABI公司SOLID技術(shù)使用的測序方法2,4，但他們的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中斷DNA合成反應(yīng)的dNTP。 圖2：Sanger法測序原理 第二代測序技術(shù) 總的說來，第一代測序技術(shù)的主要特點是測序讀長可達1000bp，準(zhǔn)確性高達 99.999%，但其測序成本高，通量低等方面的缺點，嚴重影響了其真正大規(guī)模的應(yīng)用。因而第一代測序技術(shù)并不是最理想的測序方法。經(jīng)過不斷的技術(shù)開發(fā)

5、和 改進，以Roche公司的454技術(shù)、illumina公司的Solexa，Hiseq技術(shù)和ABI公司的Solid技術(shù)為標(biāo)記的第二代測序技術(shù)誕生了。 第二代測序技術(shù)大大降低了測序成本的同時，還大幅提高了測序速度，并且保持了高準(zhǔn)確性，以前完成一個人類基因組的測序需要3年時間，而使用二代測序技術(shù)則 僅僅需要1周，但在序列讀長方面比起第一代測序技術(shù)則要短很多。表1和圖3對第一代和第二代測序技術(shù)各自的特點以及測序成本作了一個簡單的比較5，以下我將對這三種主要的第二代測序技術(shù)的主要原理和特點作一個簡單的介紹。 圖3. 測序成本的變化 1.Illumine 2.Illumina公司的Solexa和Hise

6、q應(yīng)該說是目前全球使用量最大的第二代測序機器，這兩個系列的技術(shù)核心原理是相同的2,4。這兩個系列的機器采用的都是邊合成邊測序的方法，它的測序過程主要分為以下4步，如圖4. （1）DNA待測文庫構(gòu)建 利用超聲波把待測的DNA樣本打斷成小片段，目前除了組裝之外和一些其他的特殊要求之外，主要是打斷成200-500bp長的序列片段，并在這些小片段的兩端添加上不同的接頭，構(gòu)建出單鏈DNA文庫。 （2）Flowcell Flowcell是用于吸附流動DNA片段的槽道，當(dāng)文庫建好后，這些文庫中的DNA 在通過flowcell的時候會隨機附著在flowcell表面的channel上。每個Flowcell有8個

7、channel，每個channel的表 面都附有很多接頭，這些接頭能和建庫過程中加在DNA片段兩端的接頭相互配對（這就是為什么flowcell能吸附建庫后的DNA的原因），并能支持 DNA在其表面進行橋式PCR的擴增。 （3）橋式PCR擴增與變性 橋式PCR以Flowcell表面所固定的接頭為模板，進行橋形擴增，如圖4.a所 示。經(jīng)過不斷的擴增和變性循環(huán)，最終每個DNA片段都將在各自的位置上集中成束，每一個束都含有單個DNA模板的很多分拷貝，進行這一過程的目的在于實現(xiàn) 將堿基的信號強度放大，以達到測序所需的信號要求。 （4）測序 測序方法采用邊合成邊測序的方法。向反應(yīng)體系中同時添加DNA聚合酶

8、、接頭引物和帶有 堿基特異熒光標(biāo)記的4中dNTP（如同Sanger測序法）。這些dNTP的3-OH被化學(xué)方法所保護，因而每次只能添加一個dNTP。在dNTP被添 加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會被洗脫掉。接著，再加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號，并有光學(xué)設(shè)備完成熒光信號 的記錄，最后利用計算機分析將光學(xué)信號轉(zhuǎn)化為測序堿基。這樣熒光信號記錄完成后，再加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號并去除dNTP 3-OH保護基團，以便能進行下一輪的測序反應(yīng)。Illumina的這種測序技術(shù)每次只添加一個dNTP的特點能夠很好的地解決同聚物長度的準(zhǔn)確測量問 題，它的主要測序錯誤來源是堿基

9、的替換，目前它的測序錯誤率在1%-1.5%之間，測序周期以人類基因組重測序為例，30x測序深度大約為1周。 圖4. Illumina測序流程 1.Roche 454 2.Roche 454測序系統(tǒng)是第一個商業(yè)化運營二代測序技術(shù)的平臺。它的主要測序原理是（圖5 abc）2： （1）DNA文庫制備 454測序系統(tǒng)的文件構(gòu)建方式和illumina的不同，它是利用噴霧法將待測DNA打斷成300-800bp長的小片段，并在片段兩端加上不同的接頭，或?qū)⒋郎yDNA變性后用雜交引物進行PCR擴增，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫（圖5a）。 （2）Emulsion PCR （乳液PCR，其實是一個注水到

10、油的獨特過程） 454當(dāng)然DNA擴增過程也和illumina的截然不同，它將這些單鏈DNA結(jié)合在水油包被的直徑約28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。 乳液PCR最大的特點是可以形成數(shù)目龐大的獨立反應(yīng)空間以進行DNA擴增。其關(guān)鍵技術(shù) 是“注水到油”（水包油），基本過程是在PCR反應(yīng)前，將包含PCR所有反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，水溶液瞬間形成無數(shù)個被礦物油包裹 的小水滴。這些小水滴就構(gòu)成了獨立的PCR反應(yīng)空間。理想狀態(tài)下，每個小水滴只含一個DNA模板和一個磁珠。 這些被小水滴包被的磁珠表面含有與接頭互補的DNA序列，因此這些單鏈DNA序列能夠 特異地結(jié)合在磁珠上。同時孵育體系

11、中含有PCR反應(yīng)試劑，所以保證了每個與磁珠結(jié)合的小片段都能獨立進行PCR擴增，并且擴增產(chǎn)物仍可以結(jié)合到磁珠上。當(dāng) 反應(yīng)完成后，可以破壞孵育體系并將帶有DNA的磁珠富集下來。進過擴增，每個小片段都將被擴增約100萬倍，從而達到下一步測序所要求的DNA量。 （3）焦磷酸測序 測序前需要先用一種聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白處理帶有DNA的磁珠，接著將磁珠放在一種PTP平板上。這種平板上特制有許多直徑約為44um的小孔，每個小孔僅能容納一個磁珠，通過這種方法來固定每個磁珠的位置，以便檢測接下來的測序反應(yīng)過程。 測序方法采用焦磷酸測序法，將一種比PTP板上小孔直徑更小的磁珠放入小孔中，啟動測 序反應(yīng)。測序反應(yīng)以

12、磁珠上大量擴增出的單鏈DNA為模板，每次反應(yīng)加入一種dNTP進行合成反應(yīng)。如果dNTP能與待測序列配對，則會在合成后釋放焦磷酸 基團。釋放的焦磷酸基團會與反應(yīng)體系中的ATP硫酸化學(xué)酶反應(yīng)生成ATP。生成的ATP和熒光素酶共同氧化使測序反應(yīng)中的熒光素分子并發(fā)出熒光，同時由 PTP板另一側(cè)的CCD照相機記錄，最后通過計算機進行光信號處理而獲得最終的測序結(jié)果。由于每一種dNTP在反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光顏色不同，因此可以根據(jù)熒 光的顏色來判斷被測分子的序列。反應(yīng)結(jié)束后，游離的dNTP會在雙磷酸酶的作用下降解ATP，從而導(dǎo)致熒光淬滅，以便使測序反應(yīng)進入下一個循環(huán)。由于 454測序技術(shù)中，每個測序反應(yīng)都在PTP

13、板上獨立的小孔中進行，因而能大大降低相互間的干擾和測序偏差。454技術(shù)最大的優(yōu)勢在于其能獲得較長的測序讀 長，當(dāng)前454技術(shù)的平均讀長可達400bp，并且454技術(shù)和illumina的Solexa和Hiseq技術(shù)不同，它最主要的一個缺點是無法準(zhǔn)確測量 同聚物的長度，如當(dāng)序列中存在類似于PolyA的情況時，測序反應(yīng)會一次加入多個T，而所加入的T的個數(shù)只能通過熒光強度推測獲得，這就有可能導(dǎo)致結(jié)果不 準(zhǔn)確。也正是由于這一原因，454技術(shù)會在測序過程中引入插入和缺失的測序錯誤。 圖5. Roche 454測序流程 1.Solid技術(shù) 2.Solid測序技術(shù)是ABI公司于2007年開始投入用于商業(yè)測序應(yīng)

14、用的儀器。它基于連接酶法，即利用DNA連接酶在連接過程之中測序（圖6）2,4。它的原理是： 圖6-a. Solid測序技術(shù) （1）DNA文庫構(gòu)建 片段打斷并在片段兩端加上測序接頭，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫。 （2）Emulsion PCR Solid的PCR過程也和454的方法類似，同樣采用小水滴emulsion PCR，但這些微珠比起454系統(tǒng)來說則要小得多，只有1um。在擴增的同時對擴增產(chǎn)物的3端進行修飾，這是為下一步的測序過程作的準(zhǔn)備。3修飾的微 珠會被沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過程中，沉積小室將每張玻片分成1個、4個或8個測序區(qū)域（圖6-a）。Solid系統(tǒng)最大的優(yōu)點就是每張玻

15、片能容 納比454更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實現(xiàn)更高的通量。 （3）連接酶測序 這一步是Solid測序的獨特之處。它并沒有采用以前測序時所常用的DNA聚合酶，而 是采用了連接酶。Solid連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物，這里將其簡單表示為：3-XXnnnzzz-5。連接反應(yīng)中，這些探針按照堿 基互補規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對。探針的5末端分別標(biāo)記了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM這4種顏色的熒光染料（圖6-a）。這個8堿基單鏈熒光探針中，第1和第2位堿基（XX）上的堿基是確定的，并根據(jù)種類的不同 在6-8位（zzz）上加上了不同的熒光標(biāo)記。這是Solid的獨特測序

16、法，兩個堿基確定一個熒光信號，相當(dāng)于一次能決定兩個堿基。這種測序方法也稱之為 兩堿基測序法。當(dāng)熒光探針能夠與DNA模板鏈配對而連接上時，就會發(fā)出代表第1，2位堿基的熒光信號，圖6-a和圖6-b中的比色版所表示的是第1，2位 堿基的不同組合與熒光顏色的關(guān)系。在記錄下熒光信號后，通過化學(xué)方法在第5和第6位堿基之間進行切割，這樣就能移除熒光信號，以便進行下一個位置的測序。 不過值得注意的是，通過這種測序方法，每次測序的位置都相差5位。即第一次是第1、2位，第二次是第6、7位在測到末尾后，要將新合成的鏈變性，洗 脫。接著用引物n-1進行第二輪測序。引物n-1與引物n的區(qū)別是，二者在與接頭配對的位置上相

17、差一個堿基（圖6-a. 8）。也即是，通過引物n-1在引物n的基礎(chǔ)上將測序位置往3端移動一個堿基位置，因而就能測定第0、1位和第5、6位第二輪測序完成，依此類推， 直至第五輪測序，最終可以完成所有位置的堿基測序，并且每個位置的堿基均被檢測了兩次。該技術(shù)的讀長在2×50bp，后續(xù)序列拼接同樣比較復(fù)雜。由于雙次 檢測，這一技術(shù)的原始測序準(zhǔn)確性高達99.94%，而15x覆蓋率時的準(zhǔn)確性更是達到了99.999%，應(yīng)該說是目前第二代測序技術(shù)中準(zhǔn)確性最高的了。但 在熒光解碼階段，鑒于其是雙堿基確定一個熒光信號，因而一旦發(fā)生錯誤就容易產(chǎn)生連鎖的解碼錯誤。 圖6-b. Solid測序技術(shù) 第三代測序

18、技術(shù) 測序技術(shù)在近兩三年中又有新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測序技術(shù)，被稱之為第三代測序技術(shù)。與前兩代相比，他們最大的特點就是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增。 其中PacBio SMRT技術(shù)其實也應(yīng)用了邊合成邊測序的思想5， 并以SMRT芯片為測序載體?；驹硎牵?DNA聚合酶和模板結(jié)合,4色熒光標(biāo)記 4 種堿基（即是dNTP）,在堿基配對階段,不同堿基的加入,會發(fā)出不同光,根據(jù)光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。同時這個 DNA 聚合酶是實現(xiàn)超長讀長的關(guān)鍵之一,讀長主要跟酶的活性保持有關(guān),它主要受激光對

19、其造成的損傷所影響。PacBio SMRT技術(shù)的一個關(guān)鍵是怎樣將反應(yīng)信號與周圍游離堿基的強大熒光背景區(qū)別出來。他們利用的是ZMW（零模波導(dǎo)孔）原理：如同微波爐壁上可看到的很多密集 小孔。小孔直徑有考究,如果直徑大于微波波長,能量就會在衍射效應(yīng)的作用下穿透面板而泄露出來，從而與周圍小孔相互干擾。如果孔徑小于波長,能量不會輻射 到周圍，而是保持直線狀態(tài)（光衍射的原理）,從而可起保護作用。同理,在一個反應(yīng)管(SMRTCell:單分子實時反應(yīng)孔)中有許多這樣的圓形納米小孔, 即 ZMW(零模波導(dǎo)孔),外徑 100多納米,比檢測激光波長小(數(shù)百納米),激光從底部打上去后不能穿透小孔進入上方溶液區(qū),能量被

20、限制在一個小范圍(體積20X 10-21 L)里,正好足夠覆蓋需要檢測的部分,使得信號僅來自這個小反應(yīng)區(qū)域,孔外過多游離核苷酸單體依然留在黑暗中,從而實現(xiàn)將背景降到最低。另外，可以通過檢 測相鄰兩個堿基之間的測序時間，來檢測一些堿基修飾情況，既如果堿基存在修飾，則通過聚合酶時的速度會減慢，相鄰兩峰之間的距離增大，可以通過這個來之間 檢測甲基化等信息（圖7）。SMRT技術(shù)的測序速度很快，每秒約10個dNTP。但是，同時其測序錯誤率比較高（這幾乎是目前單分子測序技術(shù)的通病），達 到15%,但好在它的出錯是隨機的，并不會像第二代測序技術(shù)那樣存在測序錯誤的偏向，因而可以通過多次測序來進行有效的糾錯。

21、圖7.PacBio SMRT測序原理 Oxford Nanopore Technologies公司所開發(fā)的納米單分子測序技術(shù)與以往的測序技術(shù)皆不同，它是基于電信號而不是光信號的測序技術(shù)5。該技術(shù)的關(guān)鍵之一是，他們設(shè)計了一種特殊的納米孔，孔內(nèi)共價結(jié)合有分子接頭。當(dāng)DNA堿基通過納米孔時，它們使電荷發(fā)生變化，從而短暫地影響流過納米孔的電流強度（每種堿基所影響的電流變化幅度是不同的），靈敏的電子設(shè)備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基（圖8）。 該公司在去年基因組生物學(xué)技術(shù)進展年會(AGBT)上推出第一款商業(yè)化的納米孔測序 儀，引起了科學(xué)界的極大關(guān)注。納米孔測序（和其他第三代測序技術(shù)）有望解決目前測序

22、平臺的不足，納米孔測序的主要特點是：讀長很長，大約在幾十kb，甚至 100 kb;錯誤率目前介于1%至4%，且是隨機錯誤，而不是聚集在讀取的兩端;數(shù)據(jù)可實時讀取;通量很高(30x人類基因組有望在一天內(nèi)完成);起始DNA在 測序過程中不被破壞;以及樣品制備簡單又便宜。理論上，它也能直接測序RNA。 納米孔單分子測序計算還有另一大特點，它能夠直接讀取出甲基化的胞嘧啶，而不必像傳統(tǒng) 方法那樣對基因組進行bisulfite處理。這對于在基因組水平直接研究表觀遺傳相關(guān)現(xiàn)象有極大的幫助。并且改方法的測序準(zhǔn)確性可達99.8%，而且一 旦發(fā)現(xiàn)測序錯誤也能較容易地進行糾正。但目前似乎還沒有應(yīng)用該技術(shù)的相關(guān)報道。 圖8. 納米孔測序 其他測序技術(shù) 目前還有一種基于半導(dǎo)體芯片的新一代革命性測序技術(shù)Ion Torrent6。 該技術(shù)使用了一種布滿小孔的高密度半導(dǎo)體芯片， 一個小孔就是一個測序反應(yīng)池。當(dāng)DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA鏈上時，會釋放出一個氫離子，反應(yīng)池中的PH發(fā)生改變，位