蛋白質(zhì)含量測定法

1、蛋白質(zhì)含量測定法Bicinchoninic acid （BCA ）法是近來廣為應(yīng)用的蛋白定量方法。其原理與Lowery法蛋白定量相似，即在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu1 +。BCA與Cu1+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在 562 nM處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測定蛋 白質(zhì)濃度。與Lowery法相比，BCA蛋白測定方法靈敏度高，操作簡單，試劑及其形成的顏 色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳，并且受干擾物質(zhì)影響小。與Bradford法相比，BCA法的顯著優(yōu)點是 不受去垢劑的影響。本實驗的目的是學(xué)會各種蛋白質(zhì)含量的測定方法。了解各種測定方法的基本原理和優(yōu)缺點。蛋白質(zhì)含量測定

2、法，是生物化學(xué)研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有 四種古老的經(jīng)典方法，即定氮法，雙縮尿法（ Biuret法）、Folin 酚試劑法（Lowry法）和 紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍使用起來的新的測定法，即考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏1020倍，比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方 法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。值得注意的是，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因為一種蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測定，有可能得出四種不同的結(jié)果。 每種測定法都不是

3、完美無缺的，都有其優(yōu)缺點。在選擇方法時應(yīng)考慮：實驗對測定所要求的靈敏度和精確度；蛋白質(zhì)的性質(zhì)；溶液中存在的干擾物質(zhì)；測定所要花費的時間?？捡R斯亮藍(lán)法（Bradford法），由于其突出的優(yōu)點，正得到越來越廣泛的應(yīng)用。一、微量凱氏（Kjeldahl）定氮法樣品與濃硫酸共熱。 含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨 （消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。 經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計算得樣 品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：CH2COOH+ 3H2SO4 一;2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH 3 NH22NH3 + H2SO4 ； （NH 4）2SO4

4、（2）（NH 4）2SO4 + 2NaOH - 2H2O +Na2SO4 + 2NH 3（3）反應(yīng)（1）、（2）在凱氏瓶內(nèi)完成，反應(yīng)（3）在凱氏蒸儲裝置中進(jìn)行。為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強(qiáng)酸。實驗和計算方法這里從略。計算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得 樣品中蛋白含量，應(yīng)將總氮量減去非蛋白 氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6. 25即得。方法靈敏度時間原理干擾物質(zhì)說明凱氏定氮法（Kjedahl 法）靈敏度低，適用于0.21.0mg氮,誤差為±2%費時810小時將蛋白氮轉(zhuǎn)化為 氨，用酸吸

5、收后滴 定非蛋白氮（可 用三氯乙酸沉 淀蛋白質(zhì)而分 離）用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 含量的準(zhǔn)確測定； 干擾少；費時太長雙縮月尿法（Biuret 法）靈敏度低1 20mg中速2030分鐘多肽鍵+堿性2CU2 T紫色絡(luò)合物硫酸?。籘ris緩沖液；某些氨基酸用于快速測定，但 不太靈敏；不同蛋 白質(zhì)顯色相似紫外吸收法較為靈敏50100 Mg快速510分鐘蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm 處的光吸收各種喋吟和喀 咤；各種核甘酸用于層析柱流出 液的檢測；核酸的 吸收可以校正Folin 酚試劑 法（Lowry 法）靈敏度局5Mg慢速40 60分鐘雙縮月尿反應(yīng)；磷鋁 酸-磷鴇酸試劑 被Tyr和Phe還原硫酸??；T

6、ris緩沖液；甘氨酸；各種硫醇耗費時間長；操作 要嚴(yán)格計時； 顏色深淺隨耳、同 蛋白質(zhì)變化考馬斯亮藍(lán)法（Bradford 法）靈敏度最高15 Mg快速515分鐘考馬斯亮藍(lán)染料 與蛋白質(zhì)結(jié)合時，其 m max 由465nm 變 為595nm強(qiáng)堿性緩沖 液；TritonX-100;SDS最好的方法； 干擾物質(zhì)少； 顏色穩(wěn)定； 顏色深淺隨耳、同 蛋白質(zhì)變化二、雙縮胭法（Biuret法）（一）實驗原理雙縮月尿（NH3CONHCONH 3）是兩 個分子月尿經(jīng)180c左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn) 物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮月尿與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮月尿反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接

7、的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮月尿反應(yīng)。R-CHCH-RH2O紫色絡(luò)合物紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)， 故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為170mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸錢、 Tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮月尿法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。（二）試劑與器材1 .試齊J:（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白（BSA）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用 BSA濃度1

8、mg/ml的A280為0.66來校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋 白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用 H2O或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0. 05N NaOH配制。（2）雙縮月尿試劑：稱以1.50克硫酸銅（CuSO4 5H2O）和6.0克酒石酸鉀鈉 （KNaC 4H4。6 4H2O）,用500毫升水溶解，在攪拌下加入 300毫升10% NaOH溶液，用水 稀釋到1升，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。2 .器材：可見光分光光度計、大試管15支、旋渦混合

9、器等。（三）操作方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取 12支試管分兩組，分別加入0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0毫升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足到 1毫升，然后加入 4毫升雙縮月尿試劑。充分搖勻后，在室溫 （2025C）下放置30分鐘，于540nm處進(jìn)行比色測定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管 作為空白對照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標(biāo)，光吸收值為縱座標(biāo)繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、樣品的測定：取 23個試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注 意樣品濃度不要超過 10mg/ml。三、Folin一酚試劑法（Lowry法）（一）實驗原理這種蛋白質(zhì)測定法是最靈敏的方法之一。

10、過去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現(xiàn)在已可以訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮月尿方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin一酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin 一酚試劑中的磷鋁酸鹽一磷鴇酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鋁蘭和鴇蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。Folin一酚試劑法最早由 Lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng) 域得到廣泛的應(yīng)用。 這個測定法的優(yōu)點是

11、靈敏度高，比雙縮月尿法靈敏得多，缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對雙縮月尿反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應(yīng)。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸俊、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%）,硫酸納（1%）,硝酸納（1%）,三氯乙酸（0.5%）,乙醇（5%）,乙醛（5%）, 丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度高時，必須作校正曲線。含硫酸鏤的 溶液，只須加濃碳酸鈉一氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會色淺， 則必須提高碳酸鈉一氫氧化鈉溶液的濃度

12、12倍。進(jìn)行測定時，加F olin一酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在 pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)Folin 一酚試劑加到堿性的銅一蛋白質(zhì)溶液 中時，必須立即混勻，以便在磷鋁酸一磷鴇酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5因。通常測定范圍是 20250%。（二）試劑與器材1 .試劑（1）試劑甲：（A） （A） 10 克 Na2CO3,2 克 NaOH 和 0.25 克酒石酸鉀鈉 （KNaC4H4。6 40）。溶解于500毫升蒸儲水中。（B） （B）0.5克硫酸銅（CuSO4-5H2O）溶解于1

13、00毫升蒸儲水中，每次使用前，將50份（A）與1份（B）混合，即為試劑甲。（2）試劑乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克鴇酸鈉（Na2WO42H2O）,25克電目酸鈉（Na2MoO 4 2H2O） 及700毫升蒸儲水，再加 50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以 小火回流10小時，回流結(jié)束時，加入 150克 硫酸鋰（Li2SO4）, 50毫升蒸儲水及數(shù)滴液 體澳，開口繼續(xù)沸騰 15分鐘，以便驅(qū)除過量的澳。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再 重復(fù)滴加液體澳的步驟）。稀釋至1升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時用標(biāo)準(zhǔn) NaOH滴定，酚酬:作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水

14、 1倍，使最終的酸濃度為 1N左右。（3）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白或J球蛋白，溶于蒸儲水，濃度為250 Ng/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9 % NaCl溶液。2 .器材（1）可見光分光光度計（2）旋渦混合器（3）秒表（4）試管16支（三）操作方法1 .標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取 16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成 兩組，分別加入 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（濃度為250%/ml）。用水補(bǔ)足到1.0毫升，然后每支試管加入 5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫 （2025C）放置10分鐘

15、。再逐管加入 0.5毫升試劑乙（Folin一酚試劑），同樣立即混勻。 這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照，于700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意：因Lowry反應(yīng)的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開始計時，1分鐘后，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管

16、， 余此類推。待最后一支試管加完試劑后，再放置 30分鐘，然后開始測定光吸收。每分鐘測 一個樣品。進(jìn)行多試管操作時，為了防止出錯，每位學(xué)生都必須在實驗記錄本上預(yù)先畫好下面的表 格。表中是每個試管要加入的量（毫升） ，并按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。最 下面兩排是計算出的每管中蛋白質(zhì)的量（微克）和測得的吸光度值。Folin一酚試劑法實驗表格：心口 呂勺12345678910標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)00.10.20.40.60.81.0(250Mg/ml)未知蛋白質(zhì)0.20.40.6(約 250%/ml)蒸儲水1.00.90.80.60.40.200.80.60.4試劑甲5.05.05.05.05.05

17、.05.05.05.05.0試劑乙0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5每管中蛋白質(zhì) 的量（為） 吸光度值（A 700）2 .樣品的測定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì)20250微克），按上述方法進(jìn)行操作，取1毫升蒸儲水代替樣品作為空白對照。通常樣品的測定也可與標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定放在一起，同時進(jìn)行。即在標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的各試管后面，再增加3個試管。如上表中的 8、9、10試管。根據(jù)所測樣品的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從而計算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。注意，由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋

18、白質(zhì)的相對濃度（相對于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。四、改良的簡易Folin一酚試劑法（一）試劑1 .試劑甲：堿性銅試劑溶液中，含 0.5N NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸鉀和0.05% 硫酸銅，配制時注意硫酸銅用少量蒸儲水溶解后，最后加入。2 .試劑乙：與前面的基本法相同。臨用時加蒸儲水稀釋8倍。3 .標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：同基本法。（二）操作步驟測定標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品溶液的操作方法與基本法相同。只是試劑甲改為1毫升，室溫放置10分鐘后，試劑乙改為4毫升。在55c恒溫水浴中保溫 5分鐘。用流動水冷卻后，在660nm 下測定其吸光度值。改良的快速簡易法，可獲得與Folin一酚試劑法（即Lowry基本法）相

19、接近的結(jié)果。五、考馬斯亮蘭法（Bradford法）（一）實驗原理雙縮月尿法（Biuret法）和Folin一酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點和許多限制，促使科 學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測定的方法。1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的 原理設(shè)計的。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法?？捡R斯亮蘭 G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置 （Xmax）,由465nm變?yōu)?95nm ,溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主 要是

20、與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測定的吸光度值 A595,與蛋白質(zhì)濃度成正比。Bradford法的突出優(yōu)點是：（1）靈敏度高，據(jù)估計比 Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá) 1Ng。這是因為 蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比 Lowry法要大的多。（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要 2分鐘即可完成，其顏色可以在 1小時內(nèi)保持穩(wěn)定， 且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lo

21、wry法那樣費時和嚴(yán)格地控制時間。（3）干擾物質(zhì)少。如干擾 Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘 油、疏基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。此法的缺點是：（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此 Bradford法用于不 同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時通常選用A球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣）。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律

22、進(jìn)行計算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。（二）試劑與器材1 .試齊J:（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用球蛋白或牛血清清蛋白（BSA）,配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。（2）考馬斯亮蘭 G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭 G250,溶于50ml 95%的乙 醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至 1升。2 .器材：3 1）可見光分光光度計(2)旋渦混合器 (3)試管16支(三)操作方法1 .標(biāo)準(zhǔn)方法(1)取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中順序，分 別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別

23、加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml,然后用無離子水補(bǔ)充到0.1ml。最后各試管中分別加入 5.0ml考馬斯亮蘭G-250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合(注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生 大量氣泡而難于消除)。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。(2)加完試劑25分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595,空白對照為第1號試管，即0.1mlH2O力口 5.0mlG 250試齊ij。注意：不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙

24、醇或丙酮長時間浸泡。考馬斯亮蘭法實驗表格:管號標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(1.0mg/ml) 未知蛋白質(zhì)(約 1.0mg/ml)蒸儲水考馬斯亮藍(lán)G 250 試齊IJ120 0.010.1 0.095.0 5.0340.020.040.08 0.065.05.00.06 0.080.04 0.025.05.0780.100.0200.085.05.09100.04 0.060.06 0.045.05.0每管中的蛋 白質(zhì)量(Mg) 光吸收值(A595)(3)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量()為橫座標(biāo)，用吸光度值 A595為縱座標(biāo)，作圖，即得到一條 標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測出的未知樣品的A595值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含

25、量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.50。2 .微量法當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時 (10100%/ml),可將取樣量(包括補(bǔ)加的水)加大到0.5ml 或1.0ml,空白對照則分別為 0.5ml或1.0ml H 2O,考馬斯亮藍(lán)G-250試劑仍加5.0ml,同時 作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定 595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.29。六、紫外吸收法蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軻雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸 收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在 280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。 此外，蛋白質(zhì)溶液在 238nm的光吸收值與肽

26、鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液 的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如 生化制備中常用的（NH4） 2SO4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，因為此時只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對值。此法的特點是測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)含量時，對那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有喋吟、喀咤及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的

27、干擾。核酸的干擾可以通過查校正表，再進(jìn)行計算的方法， 加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?。但是因為不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外，進(jìn)行紫外吸收法測定時，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測定樣品時的 pH要與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的 pH相一致。下面介紹四種紫外吸收法：1. 280nm的光吸收法因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。測定時，將待測蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑（水或

28、緩沖液）作空白對照，在紫外分光度計上直接讀取280nm的吸光度值 A280。蛋白質(zhì)濃度可控制在0.11.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿，盛有濃度為 1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液 時，A280約為1.0左右。由此可立即計算出蛋白質(zhì)的大致濃度。許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長下的光吸收值（A1%icm）有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可查，根據(jù)此光吸收值可以較準(zhǔn)確地計算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與（A1%icm）值（即蛋白質(zhì)溶液濃度為1%,光徑為1cm時的光吸收值）的關(guān)系。文獻(xiàn)值A(chǔ)1 1cm,入稱為百分吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。蛋白質(zhì)濃度 =（A280M10 ）/ A1%1cm,280nm （mg/ml

29、）（丫 1%濃度 M0mg/ml）例：牛血清清蛋白：A1%1cm=6.3 （280nm）溶菌酶：A1%1cm=22.8 （280nm）若查不到待測蛋白質(zhì)的A1%1cm值，則可選用一種與待測蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測定。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制的濃度為1.0mg/ml 0常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為牛血清清蛋白（ BSA）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取 6支試管，按下表編號并加入試劑：2 口 呂勺123456BSA (1.0mg/ml)01.02.03.04.05.0H2O5.04.03.02.01.00A 280用第1管為空白對照，各管溶液混勻后在紫外分光光度計上測定吸光度

30、A280,以A280為縱座標(biāo)，各管的蛋白質(zhì)濃度或蛋白質(zhì)量（ mg）為橫座標(biāo)作圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)為直線，利用 此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測出的未知樣品的A280值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量，也可以用 2至6管A280值與相應(yīng)的試管中的蛋白質(zhì)濃度計算出該蛋白質(zhì)的A1%icm,280nm2. 280nm和260nm的吸收差法核酸對紫外光有很強(qiáng)的吸收，在 280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng) 10倍（每克），但核酸在 260nm處的吸收更強(qiáng)，其吸收高峰在 260nm附近。核酸260nm處的消光系數(shù)是 280nm處的 2倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：純蛋白質(zhì)的光吸收比值：A280/A260 x 1.8純核酸的光吸收比值：A280/A 260歸0.5含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測定其A280和A26