酵母菌的篩選方案

1、第一部分：酵母篩選收集一.土樣中酵母的分離：1. 土壤的采集處理采用五點取樣法從葡萄地土壤中取樣。由于土壤中的微生物一般 在5-25cm的土層里，所以先用滅菌鏟除去土壤的表皮，然后采取土 壤200-300g,至于無菌塑料袋內(nèi)，并標明采取地點、日期。將其運 回實驗室后至于冰箱中保存，備用。將采回的樣品用四分法獲取樣品20-30g ,將其置于研缽中研磨均勻。2. 土壤中菌種的分離：稱取1 g 土壤，置于液體培養(yǎng)基滅菌葡萄汁，經(jīng) 28 C, 12 h , 180 rpm搖床富集培養(yǎng)。取1 ml富集培養(yǎng)液，分別進行五個梯度稀 釋（ 1:1 000、1:5000、1:10000、1:50000、1:10

2、0000）,再用移液槍分 別從每一稀釋度各取0.1ml稀釋液，注入平板上，利用涂布棒將樣品 均勻的涂在培養(yǎng)基表面（注意不能使培養(yǎng)基表面破裂），將培養(yǎng)皿蓋 好，再把培養(yǎng)皿倒置，于適宜溫度（一般為25 C或28 C）的恒溫箱中培養(yǎng)，每個梯度做三個重復(fù)。觀察培養(yǎng)基，直到菌種形成清晰易辯 的菌落為止。為了在篩選過程中排除細菌的干擾，在培養(yǎng)基中加30ug/ml的鏈霉素或者100mg/L的氯霉素。觀察并記錄菌落顏色與形態(tài)，然后在顯微觀察記錄細胞大小、形 態(tài)，進行分析和初步的歸類。二.葡萄果表酵母的分離：1.葡萄的采集：葡萄成熟時，在葡萄果皮、果梗上都有大量的酵母菌存在，因此 在采收葡萄時，將果梗與葡萄一起

3、采收。由于酵母菌在稍微破裂的葡 萄果實中大量存在，采收時可以選取有裂紋的葡萄，但是，將完整無 損的葡萄與有裂紋的分開裝袋。運回實驗室置于冰箱中保存，備用。 2.菌種分離步驟：將腐敗變質(zhì)的葡萄及雜質(zhì)從果實中挑選出來。隨機選取并稱量約10g成熟葡萄，放入盛有 90ml無菌水的三 角瓶，分別按30ug/ml添加鏈霉素，然后振蕩培養(yǎng)30min后靜置，制 成菌懸液，吸取50 ii放入YEPD固體培養(yǎng)基，三個重復(fù)，以無菌 刮鏟刮勻，25c培養(yǎng)2448h。觀察菌落的大小及生長狀況。然后將靜置后的菌懸液進行梯度稀釋（10-3、10-4、10-5、10-6、 10-7），再用移液槍分別從每一稀釋度各取 0.1m

4、l稀釋液，注入平板上， 利用涂布棒將樣品均勻的涂在培養(yǎng)基表面（注意不能使培養(yǎng)基表面破裂），將培養(yǎng)皿蓋好，再把培養(yǎng)皿倒置，于適宜溫度（一般為 25 C 或28C）的恒溫箱中培養(yǎng)，每個稀釋度做三個重復(fù)。為了在篩選過程中排除細菌的干擾，在培養(yǎng)基中加30ug/ml的鏈霉素或者100mg/L的氯霉素。觀察并記錄菌落顏色與形態(tài)，然后在顯微觀察記錄細胞大小、形 態(tài)，進行分析和初步的歸類。3 .自然發(fā)酵過程中酵母菌的分離：將腐敗變質(zhì)的葡萄及雜質(zhì)從果實中挑選出來。稱量約100g新鮮成熟度好的各品種葡萄，手工破碎，放入無菌 的500ml三角瓶，接著分別按30ug/ml添加鏈霉素，置于28c培養(yǎng)， 每隔24h取發(fā)酵

5、液1ml,加入9 ml無菌水中，然后進行梯度稀釋至 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7,取樣時期分別為：I ,葡萄漿果破碎壓 榨后（添加SO2； II ,發(fā)酵旺盛期，葡萄汁含糖量下降20%寸；III , 發(fā)酵后期，葡萄汁含糖量下降 70%寸；IV,發(fā)酵結(jié)束前，殘?zhí)?0%乂 下時。取0.1ml稀釋后各菌液放入固體培養(yǎng)基，涂布均勻（注意不能 使培養(yǎng)基表面破裂），將培養(yǎng)皿蓋好，再把培養(yǎng)皿倒置，28 c條件下使其自然發(fā)酵2448h,每個稀釋度做三個重復(fù)。為了在篩選過程中排除細菌的干擾，在培養(yǎng)基中加30ug/ml的鏈霉素或者100mg/L的氯霉素。觀察培養(yǎng)基，直到菌種形成清晰易辯的菌落為止

6、。觀察每一個菌 落，編號并作詳細描述。如：菌落顏色、表面結(jié)構(gòu)、邊緣、顏色等， 進行分析和初步的歸類。4 .設(shè)備表面酵母的分離：取擦拭過設(shè)備表面的棉球，將其中的菌液擠出，取 1m菌液經(jīng)梯 度稀釋法結(jié)合劃線分離得到單菌落。以上菌液通過梯度稀釋法進行劃 線分離單菌落：無菌條件下取1 ml含菌的樣品處理液一用無菌的生 理鹽水稀釋為若干梯度（10-1-10-7）-將稀釋液涂布于固體培養(yǎng)基平 板，28 c培養(yǎng)3d-菌落計數(shù)一觀察，編號并記錄。觀察和記錄完畢后，挑選不同菌落中的每一菌株制成水浸片 (染色)， 并編號。將各個水制片在高倍鏡下觀察各株菌的個體形態(tài)，并記錄。選出具有典型酵母菌菌落特征的單菌落，用滅

7、菌后的接種環(huán)挑去不同 菌落，在分離培養(yǎng)基上連續(xù)劃線分離 23次，進行純化。菌種的保藏：分離純化得到的酵母單菌落接種于培養(yǎng)基進行液體培養(yǎng)， 培養(yǎng)的條件 為：溫度是28 C,轉(zhuǎn)速為180 r/min ,時間為1824 h。當菌體 培養(yǎng)好后，將菌液和滅菌后的甘油按體積比為 7： 3 的比例進行混 合，混合搖勻后于-20 C下保藏待用。PS:以上分別進行培養(yǎng)基篩選試驗，可選培養(yǎng)基：(1) PD闌養(yǎng)基：去皮馬鈴薯300g,加水煮沸1020min,過濾加入葡萄糖200g, 加水至1L。滅菌。 YEPD:葡萄糖20g、蛋白月東20g、牛肉膏10g、瓊脂20g、水1000ml將葡萄糖溶解在水中，添加蛋白月東及

8、酵母浸膏，混勻后，加瓊脂 溶化，滅菌。YEPD夜體培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L,胰蛋白月東20 g/L,葡萄糖 20 g/L,瓊脂15 g/L,固體培養(yǎng)基可加入2 %瓊脂。第二部分：釀酒酵母篩選及其鑒定一篩選1釀酒酵母的無性繁殖方式篩選對液體培養(yǎng)基培養(yǎng)48h的酵母菌株，在16X40倍顯微鏡鏡檢，篩選 出以多端出芽繁殖的菌株。2 WL瓊脂培養(yǎng)基篩選釀酒酵母W閡脂培養(yǎng)基（質(zhì)量分數(shù)）：酵母浸粉0.5 ,胰蛋白月東0.5 ,葡萄糖5, 瓊脂2,磷酸二氫鉀0.055,氯化鉀0.0425,氯化鈣0.0125 ,氯化鐵 0.00025 ,硫酸鎂 0.0125 ,硫酸鎰 0.00025 ,澳甲酚綠 0.002

9、2 , pH 6.5 , 121c 滅菌 20 min ;將分離出來的酵母菌株，接種液體培養(yǎng)基活化24h后接種到W國脂培養(yǎng)基，27c培養(yǎng)5d后觀察，篩選出菌落顏色為奶油色（淺黃色） 至綠色，表面為球形突起，光滑，不透明，奶油狀的菌株。3賴氨酸培養(yǎng)基篩選賴氨酸培養(yǎng)基成分（L-1）: D-葡萄糖10g, L-組氨酸1mg DL-蛋氨酸 2mg DL-色氨酸2mg對一氨基苯甲酸200 g,生物素20 g,葉酸 2g,肌醇10mg煙酸400 wg,泛酸2mg鹽酸口比哆醇400區(qū)g,核 黃素200區(qū)g,鹽酸硫胺素400用，硼酸500/,結(jié)晶氯化銅40 碘化鉀100匐，結(jié)晶氯化鐵200用，結(jié)晶硫酸鎰400

10、結(jié)晶鋁酸 鈉200區(qū)g,結(jié)晶硫酸鋅400區(qū)g,磷酸二氫鉀850mg磷酸氫二鉀150mg 結(jié)晶硫酸鎂500mg氯化鈉100mg結(jié)晶氯化鈣100mg賴氨酸鹽酸 鹽 2.5g,瓊脂 20g, pH 自然，121c滅菌 20 min ;接種液體培養(yǎng)基活化24h后，按照1%接種量接種酵母到5mL無菌水 中進行饑餓處理，5d后，接種到賴氨酸培養(yǎng)基，27 c培養(yǎng)5d后觀 察是否有酵母生長，培養(yǎng)48h后沒有菌落出現(xiàn)的繼續(xù)培養(yǎng)，直到15d 后仍無菌落生長說明可能是釀酒酵母。二釀酒酵母的鑒定1 .形態(tài)與培養(yǎng)特征將菌種接種到液體培養(yǎng)基中，25c培養(yǎng)37d,觀察是否發(fā)酵、培養(yǎng) 液是否混濁，是否形成環(huán)或島，沉淀量多少及

11、松緊狀況，并制水浸片 于顯微鏡下觀察，記錄酵母的無性繁殖方式與細胞的形狀。 將酵母在 瓊脂培養(yǎng)基上劃線，于28 c培養(yǎng)3d4d,觀察其菌落形態(tài)。2 .酵母假菌絲的觀察將菌株在25c活化后，在瓊脂平板上劃線接種（每個平板2-3條），在國線上蓋上無困蓋玻片，在 28c下培養(yǎng)5d10d。3 .酵母菌子囊抱子的觀察產(chǎn)子囊抱子培養(yǎng)基：酵母膏3g、麥芽汁3g、蛋白月東5g、葡萄糖10 g、 瓊脂20g、水1000 mL。上述培養(yǎng)基于121 C滅菌20min,做斜面； 菌株在25c瓊脂培養(yǎng)基活化1-2d后，接種到生抱培養(yǎng)基斜面上劃 線，25 C培養(yǎng)3d,鏡檢是否有子囊抱子。凡未見抱子的在17 C左右保持46

12、周，每周再檢查是否出現(xiàn)子囊抱子。4 .同化碳源試驗鑒定所需同化物質(zhì)共18種，為半乳糖、棉籽糖、赤罅糖醇、蔗糖可 溶性淀粉、核糖醇、麥芽糖、D-木糖、D-甘露糖醇、纖維二糖、L-阿拉伯糖、琥珀酸、海藻糖、D-核糖、檸檬酸、乳糖、L-鼠李糖和肌 醇。將上述糖分別加入到含有杜氏發(fā)酵管的氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基（YNB）中，使糖濃度達到50 mmol/L,經(jīng)過濾（0.20 m）除菌。以含YNB而 不含碳源的試管作為不生長的空白對照。酵母菌經(jīng)活化后分別接入到 上述培養(yǎng)基中，25c條件下培養(yǎng)分別在1、2和第3周觀察，以試管 中出現(xiàn)混濁計為陽性，否則計為陰性。重復(fù) 3次，結(jié)果觀察標準：將 已培養(yǎng)數(shù)天的試管于混合振蕩器

13、上搖動，使內(nèi)容物充分混勻。在一張白色卡片上畫一條約 3/4mm寬的線，將卡片緊靠試管，直對自然光 觀察，如果能看到不連續(xù)線段的清晰邊緣，則記為 +;如果溶液非常 澄清，記為-,表示未有酵母生長。5 .發(fā)酵糖類試驗鑒定所需發(fā)酵碳源為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、棉子糖、菊糖 乳糖和核糖。將上述糖分別加入到含有杜氏發(fā)酵管的生理生化培養(yǎng)基 中，使糖的濃度達到50 mmol/L ,經(jīng)過濾（0.20 m）除菌。酵母菌 經(jīng)活化后分別接入到上述培養(yǎng)基中，25c條件下培養(yǎng)，每隔2d觀察 發(fā)酵情況，連續(xù)觀察2周，4周后再觀察一次，每次觀察時注意杜氏 小管中氣體的量，以及出現(xiàn)的速度，判斷發(fā)酵情況。以杜試管中有氣

14、泡記為陽性，無氣泡為陰性，三次重復(fù)。6 .同化氮源供試氮源有硫酸鏤、天門冬素、硝酸鉀、亞硝酸鈉、 L-賴氨酸。該試 驗主要考察酵母菌在分別以硫酸鏤、天門冬素、硝酸鉀、亞硝酸鈉、 L-賴氨酸為惟一氮源時的生長情況。碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入硝酸鉀， 加入量為0.078%（w/w）, 115c滅菌20min。接種隔夜活化的酵母，于 25c培養(yǎng)1周。試驗設(shè)置3個重復(fù)，以不加入氮源的培養(yǎng)基作為對照。7 .生成類淀粉化合物試驗生成類淀粉化合物培養(yǎng)基：硫酸鏤 0.2%、磷酸二氫鉀0.2%、七水合 硫酸鎂0.1%、酵母膏0.1%、葡萄糖2%瓊脂2%上述培養(yǎng)基溶于蒸 儲水中，并用鹽酸調(diào)整溶液pH值達4.8,然后于1

15、15c滅菌20 min; 接種隔夜活化的酵母，28c培養(yǎng)12d后，在平板長菌處周圍滴加 Lugol's碘液，凡能產(chǎn)生類淀粉化合物的酵母會在菌落周圍呈現(xiàn)藍紫 色或綠色為正反應(yīng)，即能生成類淀粉。有時出現(xiàn)棕色是肝糖反應(yīng)，會 混淆結(jié)果，因此應(yīng)將培養(yǎng)物保存幾小時或過夜，如是棕色則會消失， 而藍色仍然會保留。8 . 0.1%、0.01%放線菌酮抗性測試溶解1g放線菌酮于2.5mL丙酮中，向丙酮溶液中加入6.7g氮源基礎(chǔ) 培養(yǎng)基，再加入含10g葡萄糖的蒸儲水，充分混勻后過濾(0.20 m) 除菌。取上述溶液加入到有蒸儲水 (已高壓滅菌)的試管中，制成含 0.1%、0.01%放線菌酮的培養(yǎng)基。向培養(yǎng)基

16、中接種已活化好的酵母， 25c培養(yǎng)3周。結(jié)果觀察標準同碳源同化測試。三.菌株26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析1 .菌落PCR DNA的制備：挑取新鮮單菌落置于 30履0.2% SDS中；漩渦混勻器上混勻 15 秒；90c 熱激 4min; 4c 13000rpmX 1min,離心，取上清液 20L 至新的無菌離心管中，-20 C保藏。2 .菌株26SrDNAD1/D2區(qū)的PCR擴增26SrDNAD1/D2 區(qū) PCR 擴 增的引 物對為 NL1 ( 5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3' 和NL4(5'-GGTCCGTGECAAGACGG-3

17、' ); Taq DNA Polymerse Buffer (1X), MgCl2 2.0mmol/L, dNTPs 40 mol/L , Taq 酶 1U,模板 DNA60ng ,引物各0.6"mol/L ,加超純水至50 “。反應(yīng)程序為 95 C 5min; 94 C 1min； 52 c 1min； 72 c 1min20s,循環(huán) 36 次；72 c 延 伸8min。所彳# PCR產(chǎn)物使用凝膠回收試劑盒進行純化后， 送出去進 行測序。第四部分：耐受性分析1 .酒精耐受性測定將滅菌后的YEPDM養(yǎng)基B等溫至40 c左右，按10%、12% 14% 16% 18%(v/v)的

18、濃度加入乙醇，接種新鮮單菌落在 YEP阡板進行生長實 驗，一周后以生長狀況表征其酒精耐受性。2 .滲透脅迫耐受性測定力口入 0.7mol/L、1.0mol/L、1.2 mol/L、1.4 mol/L、1.6 mol/L、1.8 mol/L、2.0 mol/L、2.2 mol/L、2.4 mol/L KCL 至U YPD液體培養(yǎng)基 中，接種新鮮單菌落進行生長實驗，以生長狀況表征其滲透脅迫耐受 性。培養(yǎng)2d后以生長狀況表征其耐受性。3 .高溫耐受性測定在37 c和42 c下，YEPD斜面培養(yǎng)進行生長實驗，以生長狀況表征 其高溫耐受性。培養(yǎng)兩周后以生長狀況表征耐受性。4 .營養(yǎng)饑餓耐受性測定將各菌株在無菌水中25c分別靜置饑餓5d、6d、7d、8d、9d、10d, 在YPD夜體培養(yǎng)基進行生長實驗，培養(yǎng) 2d后以生長狀況表征其營養(yǎng) 饑餓耐受性。5 .高糖耐受性測試在含有10% 20% 30% 40% 50% 60%勺葡萄糖的 YEPD斗面培養(yǎng)基 進行生長實驗，以生長狀況表征其對不同濃度糖的耐受性。 培養(yǎng)兩周 后觀察生長差異。6 .低pH值的耐受性測試在 pH值分別為 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.