偽狂犬病活疫苗講述

1、偽狂犬病活疫苗(Bartha-K61株)生產(chǎn)工藝規(guī)程編制人廠 年月日審核人： 年月日批準(zhǔn)人： 年月日一、目 的：偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）生產(chǎn)工藝規(guī)程的方法和程序。二、適用范圍：適用于偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的生產(chǎn)的全過(guò)程三、依 據(jù)：偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程四、責(zé)任者：生產(chǎn)車間、質(zhì)管部。五、正 文：I工藝流程及質(zhì)量控制要點(diǎn)II操作細(xì)則1、制苗材料的制備2、生產(chǎn)用種毒的制備3、半成品的配制4、配苗5、疫苗的分裝6、疫苗的凍干7、軋蓋貼標(biāo)8、包裝III成品檢驗(yàn)IV工藝衛(wèi)生與人員衛(wèi)生V生產(chǎn)設(shè)備一覽表VI包裝機(jī)檢查方法VII物料平衡VII

2、I勞動(dòng)定員及勞動(dòng)保護(hù)吉林和元生物工程有限公司GMP管理文件題目偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）生產(chǎn) 工藝規(guī)程編碼：SOP-SC-共13頁(yè)制定審核批準(zhǔn)制定日期審核日期批準(zhǔn)日期頒發(fā)部門辦公室頒發(fā)數(shù)量生效日期分發(fā)單位辦公室、勺匸產(chǎn)技術(shù)部、質(zhì)管部一、U 的：規(guī)定制造偽狂犬病活疫苗（B吐tha-K61株）的方法和程序。二、適用范圍：適用于偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的生產(chǎn)的全過(guò)程三、依 據(jù)：偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程四、責(zé)任者：生產(chǎn)車間、質(zhì)管部。五、正 文:【品名】偽狂犬病活疫苗（Barthd-K61株）【質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)】本企業(yè)偽狂犬病活疫苗（Barthd-

3、K61株）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)【外觀】本品為淡黃色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解?！疽?guī)格】10頭份/瓶、20頭份/瓶、70頭份/瓶【儲(chǔ)藏】在-15°C以下，有效期暫定為18個(gè)月【作用與用途】用于高致病性豬繁殖與呼吸綜合征。免疫期為4個(gè)月?！居梅ㄅc用量】1按瓶簽注明的頭份加生理鹽水稀釋，耳根后部肌肉注射。2仔豬斷奶前免疫1次，1頭份/頭。3母豬配種前免疫1次，1頭份/頭。【成品代碼】C【批量】40000 瓶I工藝流程及質(zhì)量控制要點(diǎn)偽狂犬病活疫苗（B吐tha-K61株）質(zhì)量控制要點(diǎn)工序質(zhì)量控制要點(diǎn)質(zhì)量控制項(xiàng)目頻次毒種制備種毒無(wú)菌檢驗(yàn)每批病毒含量每批細(xì)胞制備消化時(shí)間、溫度每批細(xì)胞外源

4、病毒檢驗(yàn)每批毒液制備接種接種量每批觀察細(xì)胞再生狀況每批半成品檢驗(yàn)無(wú)菌檢驗(yàn)每批病毒含量每批配苗半成品、保護(hù)劑無(wú)菌檢驗(yàn)每批配苗比例每批分裝分裝過(guò)程無(wú)菌檢驗(yàn)分裝過(guò)程中前、中、后檢驗(yàn)分裝量間隔半小時(shí)標(biāo)定分裝量?jī)龈蓛龈汕€共融點(diǎn)、真空度每批成品檢驗(yàn)成品理化指標(biāo)每批無(wú)菌檢驗(yàn)每批鑒別檢驗(yàn)每批效力檢驗(yàn)每批安全檢驗(yàn)每批外源病毒檢驗(yàn)每批支原體檢驗(yàn)每批II操作細(xì)則本品系用偽狂犬病病毒弱毒株接種于雞胚成纖維細(xì)胞收獲感染病毒液，加適宜穩(wěn)定劑, 經(jīng)冷凍干燥制成，用于預(yù)防豬、牛及綿羊偽狂犬病。1制苗材料的制備1.1條件準(zhǔn)備1.1.1根據(jù)細(xì)胞制備所需物品及設(shè)備條件，進(jìn)行全面準(zhǔn)備。1. 1. 2 按使用時(shí)間，提前做好滅菌工作后

5、將準(zhǔn)備好的各種物品提前移入潔凈工作間待用。1.1.3在工作開始前3040min,按凈化級(jí)別要求調(diào)整送風(fēng)量，達(dá)到潔凈級(jí)別要求。1.2操作規(guī)則1.2. 1細(xì)胞的制備1.2. 1. 1制苗用細(xì)胞的來(lái)源發(fā)育良好的910日齡SPF雞胚。1.2. 1.2細(xì)胞制備選擇910日齡發(fā)育良好的SPF雞胚，先用碘酒棉消毒蛋殼氣室部位，無(wú)菌取出雞胚，去頭、四肢和內(nèi)臟，放入滅菌的玻璃器川1中，用漢克氏液洗滌胚體，用滅菌剪刀剪成米粒大 小的組織塊，再用漢克氏液洗滌23次，然后加0.25%胰酶溶液（每胚4ml）, 37. 538. 5°C 消化2030分鐘，吸出胰酶溶液，用漢克氏液洗滌23次再加入適量的營(yíng)養(yǎng)液（用

6、含5% 10%犢牛血清乳漢液，加適宜的抗生素適量）吹打，用46層紗布過(guò)濾，制成每lml含活細(xì) 胞數(shù)約100150萬(wàn)的細(xì)胞懸液，分裝于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，形成單層后備用。細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)無(wú)細(xì)菌、霉菌（見(jiàn)無(wú)菌（純粹）檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程）和支原體（見(jiàn)支 原體檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程）污染，無(wú)特異性病變。將細(xì)胞凍融液接種Marc-145細(xì)胞，應(yīng)不出現(xiàn)任何病變（見(jiàn)外源病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程）。1. 3清場(chǎng)和記錄1.3.1工作結(jié)束后，應(yīng)全面清場(chǎng)，對(duì)工作間、所用器具、玻璃器皿、物料及廢棄物等應(yīng)按規(guī) 定分別進(jìn)行處理。1. 3. 2全面填寫生產(chǎn)工序記錄。2生產(chǎn)用毒種的制備2. 1條件準(zhǔn)備2.1.1根據(jù)毒種制備所需物料及設(shè)備條件，

7、進(jìn)行全面準(zhǔn)備。2.1.2按使用時(shí)間，將準(zhǔn)備好的各種物品提前移入潔凈工作間待用。2.1.3在工作開始前3040min,按凈化級(jí)別要求調(diào)整送風(fēng)量，達(dá)到潔凈級(jí)別要求。-13-2.2操作規(guī)則2. 2. 1制苗用病毒液的制備2. 2. 2. 1細(xì)胞單層培養(yǎng) 將擴(kuò)大培養(yǎng)的種子細(xì)胞接種到轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)，控制轉(zhuǎn)速曠12轉(zhuǎn)/小時(shí)。2.2. 1.2接種 取所需數(shù)量的、細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%以上的細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶，棄去生長(zhǎng)液，按2% （V/V）接種病毒，加入含2%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，37° C旋轉(zhuǎn)（912轉(zhuǎn)/小時(shí)）培養(yǎng)。2. 2. 1. 3收獲 在顯微鏡下觀察111病毒引起的細(xì)胞病變（CPE）,直至CPE達(dá)到70%以

8、上收獲細(xì) 胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融1次，經(jīng)離心或過(guò)濾除去細(xì)胞碎片，凍存于-40° C以下。2.2.2毒種鑒定2. 2. 2. 1弱毒標(biāo)準(zhǔn)2. 2. 2. 2病毒含量 將毒種用無(wú)血清培養(yǎng)基做10倍系列稀釋，取10匕10”、10一；4個(gè)稀釋度，分別接種于96孔細(xì)胞板，每個(gè)稀釋度接種6孔，每孔0. ImL,設(shè)置正常的細(xì)胞對(duì)找孔, 放置5%CO:, 37°C下培養(yǎng)觀察35日，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算TCI%。病毒含量應(yīng)107 °TCID50o2. 2. 2. 3鑒別檢驗(yàn)中和試驗(yàn)：將毒種用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋成103TCID50/mL,取0. ImL與等量呼吸綜合征病 毒特異

9、性陽(yáng)性血清混合，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照組和正常細(xì)胞對(duì)照組，37°C作用1小時(shí)后，接種 Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)板，觀察5日。應(yīng)不產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE）。1. 2. 2. 2病毒基因鑒定 應(yīng)用下列引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，毒種可擴(kuò)增出581bp的特異性條帶, 以而豬繁殖與呼吸綜合征病毒NVDC-JXA1-R株為代表的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒以 及其他豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸為陰性（豬繁殖與呼吸綜合征病毒JXA1-R株RT-PCR檢 測(cè)方法見(jiàn)附注3）。U1 ATTTGAATGTTCGCACGGTCTCD2 CGGAACCATCAAGCACAACTCT2. 2. 2. 4 毒力對(duì)仔豬的毒力

10、 用JXA1-R-R株毒種（MlOrcm/nL）接種4、6周齡抗原豬繁殖與 呼吸綜合征病毒、抗體陰性仔豬（陰性豬標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)附注1） 5頭，每頭頸部肌肉注射2mL,同時(shí) 設(shè)5頭陰性豬作對(duì)照，隔離飼養(yǎng)。接種豬逐日測(cè)量體溫，觀察臨床癥狀，均不發(fā)病（發(fā)病豬 判定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)附注2 ）。對(duì)妊娠母豬的毒力 用JXA1-R-R株毒種（事訶°TCID5°/mL）接種懷孕80為0天的母豬 3頭，每頭頸部肌肉注射2mL,同時(shí)設(shè)同期懷孕母豬3頭做對(duì)照，隔離飼養(yǎng)，觀察母豬臨床癥 狀和分娩產(chǎn)仔狀況。懷孕母豬應(yīng)不發(fā)生流產(chǎn)，所產(chǎn)仔豬的存活率與未接種對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差 異。2. 2. 2. 5免疫原性 取46周齡豬繁

11、殖與呼吸綜合征病毒抗原、抗體陰性豬（陰性豬標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn) 附注1） 10頭，其中5頭肌肉注射JXA1-R-R株毒種2mL （105 °TCID5o/mL）,另5頭作為對(duì)照, 同條件下隔離飼養(yǎng)。28日后，所有豬肌肉注射檢驗(yàn)用強(qiáng)毒NVDC -JXA1株病毒培養(yǎng)液（病毒 含量lO15TCID3o/mL） 3mL,每天測(cè)溫并觀察21日。對(duì)照豬均應(yīng)發(fā)病，且至少2頭死亡，免 疫豬應(yīng)至少4頭保護(hù)（發(fā)病豬判定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)附注）。2. 2. 2. 6純凈 按現(xiàn)行中國(guó)獸藥典進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體和外源病毒污染。2. 2. 3基礎(chǔ)種子代數(shù)82、90代。2. 2. 4 種毒保存-70°C下，保存期暫定

12、為12個(gè)月。2. 2. 5強(qiáng)毒標(biāo)準(zhǔn)2. 2. 5. 1病毒含量將毒種用無(wú)血清培養(yǎng)基做10倍系列稀釋，取IO'3. 10- ICT5、10勺個(gè)稀 釋度，分別接種于96孔細(xì)胞板，每個(gè)稀釋度接種6孔，每孔0. ImL,在37°C下培養(yǎng)觀察外7 日，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算TCID。病毒含量應(yīng)105 5TCID5o/mLo2. 2. 5. 2對(duì)豬的毒力 取曠10周齡的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原抗體陰性豬（陰性豬標(biāo)準(zhǔn) 見(jiàn)附注1） 5頭，每頭豬肌肉注射檢驗(yàn)用強(qiáng)毒NVTC-JXA1-R （1O, s's oTCID5o/idL） 3mL,每天測(cè)溫 并觀察21 Bo豬均應(yīng)發(fā)病

13、，且至少2頭死亡。1.3.3毒種代次56代。2. 2.6毒種保存 在-70°C以下，保存期暫定為12個(gè)月。3細(xì)胞系病毒培養(yǎng)用細(xì)胞為Marc-145,山中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心鑒定、保管和供應(yīng)。3. 1細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)3. 1. 1細(xì)胞形態(tài)用含8%犢牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，37°C.5%C02培養(yǎng)2h即可貼壁，24h 內(nèi)可長(zhǎng)成單層。顯微鏡下，細(xì)胞呈三角形、多角形、圓形等多種形態(tài)。3. 1. 2外源病毒檢驗(yàn)3. 1. 2. 1致細(xì)胞病變病毒檢驗(yàn) 取2個(gè)細(xì)胞單層，每個(gè)單層至少6cm',培養(yǎng)7天，每日觀察細(xì) 胞，應(yīng)無(wú)細(xì)胞病變。3. 1.2. 2血吸附病毒檢驗(yàn) 按現(xiàn)行中國(guó)獸藥典進(jìn)

14、行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。3. 1.2.3其它特定病毒的檢驗(yàn) 采用PCR或RT-PCR方法檢測(cè)，應(yīng)無(wú)BVDV、PCV、CSFV、PPV、 PRV和JEV污染。3.1.3胞核學(xué)檢查 對(duì)不同傳代水平的細(xì)胞，取50個(gè)處于有絲分裂中期的細(xì)胞進(jìn)行檢查。在 基礎(chǔ)細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞中存在的染色體標(biāo)志，在最高代次細(xì)胞中也應(yīng)存在。與基礎(chǔ)細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞相 比，所有細(xì)胞的染色體模式數(shù)不得高出15%。核型必須相同。3. 1. 4致瘤性檢驗(yàn) 用無(wú)胸腺小鼠至少10只，各皮下或肌肉注射10個(gè)待檢細(xì)胞，同時(shí)用Hela 細(xì)胞皮下或肌肉注射無(wú)胸腺小鼠，每只1（/個(gè)細(xì)胞，作為陽(yáng)性對(duì)照，用雞胚成纖維細(xì)胞作為 陰性對(duì)照。觀察21日，Marc-

15、145細(xì)胞應(yīng)無(wú)腫瘤形成，陽(yáng)性對(duì)照組應(yīng)出現(xiàn)明顯的腫瘤，陰性 對(duì)照組應(yīng)為陰性。3.1.5無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行中國(guó)獸藥典進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。3.1.6支原體檢驗(yàn) 按現(xiàn)行中國(guó)獸藥典進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)支原體生長(zhǎng)。3. 2細(xì)胞代次 基礎(chǔ)細(xì)胞應(yīng)為P10代，工作細(xì)胞代次應(yīng)為1025代，生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)在40代 以內(nèi)。3. 3保存 液氮保存。保存期36個(gè)月。4 疫苗制造及半成品檢驗(yàn)4. 1生產(chǎn)用毒種制備4. 1. 1毒種繁殖 將已長(zhǎng)成單層的Marc-145細(xì)胞倒去生長(zhǎng)液,換以含2%毒種的細(xì)胞維持液, 置37°C下培養(yǎng)2、3天，當(dāng)70%以上細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)收獲，置-40C凍融1次，離心后分裝， 然后進(jìn)行鑒定。4. 1

16、. 2毒種鑒定 按1.2.1、1.2.2、1.2.5項(xiàng)進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。符合上述標(biāo)準(zhǔn)的毒種作為 生產(chǎn)用毒種。4. 1. 3毒種保存 在-70°C下保存，應(yīng)不超過(guò)12個(gè)月。4. 1.4毒種繼代 應(yīng)不超過(guò)3代。4. 2清場(chǎng)和記錄4. 2. 1工作結(jié)束后，應(yīng)全面清場(chǎng)，對(duì)工作間、所用器具、玻璃器皿、物料及廢棄物等應(yīng)按規(guī) 定分別進(jìn)行處理。4. 2. 2全面填寫生產(chǎn)記錄。5半成品的制備5. 1條件準(zhǔn)備5.1.1根據(jù)毒液繁殖所需物料及設(shè)備條件，進(jìn)行全面準(zhǔn)備。5.1.2按使用時(shí)間，將準(zhǔn)備好的各種物品提前移入潔凈工作間待用。5.1.3在工作開始前3040min,按凈化級(jí)別要求調(diào)整送風(fēng)量，達(dá)到潔凈級(jí)別要

17、求。5.2操作規(guī)則5.2.1 接種 取所需數(shù)量的、細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%以上的細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶，棄去生長(zhǎng)液，按2% （V/V）接種病毒，加入含2%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，37° C旋轉(zhuǎn)（912轉(zhuǎn)/小時(shí)）培養(yǎng)。5.2.2 收獲 在顯微鏡下觀察III病毒引起的細(xì)胞病變（CPE）,直至CPE達(dá)到70%以上收獲 細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融1次，經(jīng)離心或過(guò)濾除去細(xì)胞碎片，凍存于-40° C以下。5. 3半成品檢驗(yàn)5. 3. 1病毒含量取病毒液按1. 2. 1項(xiàng)進(jìn)行檢驗(yàn)，病毒含量應(yīng)lOTCIDso/mLo5. 3.2 無(wú)菌檢驗(yàn) 按現(xiàn)行中國(guó)獸藥典進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。5. 4清場(chǎng)和記錄5. 4. 1工作結(jié)

18、束后，應(yīng)全面清場(chǎng)，對(duì)工作間、所用器具、玻璃器皿、物料及廢棄物等應(yīng)按規(guī) 定分別進(jìn)行處理。5. 4. 2全面填寫生產(chǎn)記錄。6配苗6. 1條件準(zhǔn)備6.1.1根據(jù)配苗所需物料及設(shè)備條件，進(jìn)行全面準(zhǔn)備。6.1.2按使用時(shí)間，將準(zhǔn)備好的各種物品提前移入潔凈工作間待用。6.1.3在工作開始前3040min,按凈化級(jí)別要求調(diào)整送風(fēng)量，達(dá)到潔凈級(jí)別要求。6.1.4將檢驗(yàn)合格的半成品于配苗前取出，融化待用。6.2操作規(guī)則6. 2.1配制將經(jīng)檢驗(yàn)合格的病毒液按比例添加蔗糖脫脂乳凍干保護(hù)劑，充分混合均勻。6. 3清場(chǎng)和記錄6. 3.1工作結(jié)束后，應(yīng)全面清場(chǎng)，對(duì)工作間、所用器具、玻璃器皿、物料及廢棄物等應(yīng)按規(guī) 定分別進(jìn)

19、行處理。6. 3. 2全面填寫生產(chǎn)記錄。7疫苗的分裝操作內(nèi)容見(jiàn)分裝崗位標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。8疫苗的凍干操作內(nèi)容見(jiàn)凍干標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。7軋蓋、貼標(biāo)操作內(nèi)容見(jiàn)軋蓋標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、貼標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。8包裝操作內(nèi)容見(jiàn)包裝標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程III成品檢驗(yàn)見(jiàn)偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程IV、工藝衛(wèi)生與人員衛(wèi)生1定期對(duì)潔凈室進(jìn)行消毒，并根據(jù)沉降菌測(cè)定結(jié)果決定消毒周期。2操作間的衛(wèi)生按各自區(qū)域的清潔消毒規(guī)程進(jìn)行。3生產(chǎn)設(shè)備按各自清潔規(guī)程進(jìn)行清潔消毒。4原輔料進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)按規(guī)定程序進(jìn)行清潔消毒。5人員進(jìn)入潔凈區(qū)時(shí)，必須按規(guī)定進(jìn)行人凈。進(jìn)入潔凈區(qū)程序：更鞋一脫外 衣一穿普通工作服一更鞋一脫普通工作服一洗手-> 穿潔凈服一手消毒一進(jìn)入十萬(wàn) 級(jí)潔凈區(qū)一更鞋一手消毒一套潔凈服一手消毒一進(jìn)入萬(wàn)級(jí)潔凈區(qū)。6人員在生產(chǎn)區(qū)內(nèi)按區(qū)域個(gè)人衛(wèi)生要求進(jìn)行管理。7 一般區(qū)工作服每三天清洗一次，十萬(wàn)級(jí)區(qū)工作服每天清洗一次，萬(wàn)級(jí)區(qū)工 作服每班清洗一次，萬(wàn)級(jí)潔凈區(qū)使用的工作服在清洗后進(jìn)行滅菌，活毒操作區(qū)的工 作服須經(jīng)滅菌后才能進(jìn)行清洗。8潔凈室溫度控制在1826°C,相對(duì)濕度控制在30-63%。潔凈區(qū)與非潔凈 區(qū)的靜壓差應(yīng)$10帕。不同級(jí)別的相鄰潔凈區(qū)間壓差應(yīng)$5帕。9每批生產(chǎn)完畢，都應(yīng)按清場(chǎng)管理規(guī)程進(jìn)行清場(chǎng)。更換產(chǎn)品應(yīng)進(jìn)行徹底清