掃描電子顯微鏡生物樣品制備與觀察細(xì)胞生物學(xué)實驗報告

1、細(xì)胞生物學(xué)實驗報告掃描電子顯微鏡生物樣品制備與觀察 姓名： 學(xué)號： 班級： 專業(yè)： 同組成員： 【實驗?zāi)康摹?、 了解掃描電鏡的基本結(jié)構(gòu)與工作原理2、 了解掃描電鏡的基本使用方法3、 了解臨界點干燥儀的工作原理了解掃描電鏡生物樣品制備的基本過程【實驗原理】掃描電鏡主要用于觀察樣品表面幾何形貌。一般掃描電鏡生物樣品制備過程包括取材、固定、脫水、干燥以及導(dǎo)電處理等步驟。取材時應(yīng)盡量保護待觀察的樣品表面（如細(xì)胞表面、組織或器官的上皮表面等），并且避免樣品表面在清洗過程中的人為損傷。一般生物樣品需經(jīng)干燥后才能在掃描電鏡下觀察。由于表面張力的作用，含水量大的生物樣品在自然干燥過程中，其表面形貌將發(fā)生嚴(yán)重

2、變形。為了觀察生物樣品真實的表面形貌，通常采用臨界點干燥法對樣品進行干燥處理。當(dāng)氣液兩相處于臨界點時，氣體、液體密度相等，表面張力為零。因此，對生物樣品進行臨界點干燥，可以較好地保護其表面形貌。水的臨界溫度和壓力分別為374.1和218.3大氣壓，顯然，此條件下生物樣品將受到嚴(yán)重?fù)p壞。由于CO2的臨界溫度和壓力較低，為31.4和72.9大氣壓，故通常選擇CO2作為生物樣品臨界點干燥的工作介質(zhì)。固定、脫水后的樣品需經(jīng)過乙酸異戊酯處理，然后利用臨界點干燥儀對樣品進行干燥。由于生物樣品導(dǎo)電性低，未經(jīng)過導(dǎo)電處理的樣品在掃描電鏡下觀察時會產(chǎn)生荷電現(xiàn)象，從而影響觀察和照相記錄。為了減少荷電效應(yīng)，對生物樣品

3、表面要進行導(dǎo)電處理，通常使用離子濺射儀在樣品表面噴鍍金屬導(dǎo)電薄層。噴鍍的金屬包括：金（Au），鉑（Pt）及其合金等，噴鍍導(dǎo)電薄層厚度在10nm左右為宜。對于花粉粒等含水量較少的生物樣品，可以經(jīng)過自然干燥后在掃描電鏡下觀察。入射電子術(shù)與固體樣品原子之間的相互作用1、入射電子術(shù)與固體樣品原子之間的相互作用。具有一定的能量的電子入射固體厚樣品后收到樣品原子的散射，產(chǎn)生二次電子、背散射電子以及特征x射線等。二次電子是從樣品表面約10nm深度范圍內(nèi)被入射電子激發(fā)的低能電子，其能量約為050eV。一部分入射電子在樣品內(nèi)部經(jīng)多次散射后從樣品表面射出，這些電子被稱為背散射電子。樣品中不同元素的原子在受到入射電

4、子電離激發(fā)時可以發(fā)射特征X射線。掃描電鏡主要是利用二次電子像觀察厚樣品表面形貌。在觀察樣品微區(qū)表面形貌的同時，利用X射線顯微分析技術(shù)可以對樣品中的元素進行定性和定量分析。2、掃描電鏡的基本組成和成像過程掃描電鏡成像系統(tǒng)的基本組成由圖1-1所示。電子槍、聚光鏡和物鏡等組成掃描電鏡的電子光學(xué)系統(tǒng)。電子槍發(fā)射的電子經(jīng)聚光鏡和物鏡的會聚作用形成極細(xì)的電子束入射樣品。在掃描偏轉(zhuǎn)線圈的控制下，入射電子束在樣品表面做光柵狀掃描。掃射過程中產(chǎn)生的二次電子由光電倍增管檢測，該信號經(jīng)視頻放大器放大后輸入觀察顯示器的柵極以調(diào)制其亮度。由于入射電子束與觀察顯示器的掃描偏轉(zhuǎn)線圈均由同一掃描信號發(fā)生器控制，所以兩者掃描同

5、步。當(dāng)入射電子束對樣品某區(qū)域掃描時，在顯示器上可以觀察到該區(qū)域的二次電子像。像點的亮度與樣品物點上所產(chǎn)生的二次電子信號強度相關(guān)。當(dāng)來自物點的二次電子信號強時，對應(yīng)的像亮點；反之則暗。3、掃描電子顯微鏡的技術(shù)指標(biāo)分辨率、加速電壓和放大倍數(shù)是掃描電鏡的基本技術(shù)參數(shù)。掃描電鏡的分辨率通常指二次電子像分辨率，該分辨率與入射電子束斑直徑有關(guān)。配備熱發(fā)射電子槍的掃描電鏡分辨率約為3nm，而高分辨率場發(fā)射掃描電鏡的分辨率在1nm左右。掃描電鏡加速電壓范圍約為1-20kV。掃描電鏡的放大倍數(shù)由觀察顯示器的尺寸與入射電子束在樣品掃描區(qū)域尺寸之間的比值決定。通過改變?nèi)肷潆娮邮鴴呙鑵^(qū)域的大小，可以提高或降低放大倍數(shù)

6、，其范圍為數(shù)十倍至數(shù)十萬倍。4、二次電子像的襯度機制二次電子的產(chǎn)率定義為二次電子數(shù)與入射電子數(shù)之間的比值，并且1cos，為入射電子束與樣品表面法線之間的夾角。由于樣品表面不是平整的，各點的值與值不同，即樣品表面各點的二次電子信號強度不同。因此二次電子像的襯度反應(yīng)樣品表面幾何形貌。此外，由于入射電子束孔徑角很小，二次電子像還具有景深大，立體感強的特點。【實驗器材】（1）實驗儀器  掃描電鏡、離子濺射儀（2）實驗材料  樣品臺、雙面膠帶、掃描電鏡生物樣品（百合花粉粒） 【方法與步驟】（1） 在樣品上粘貼雙面膠帶，將自然干燥的百合花花粉粒分散、均勻的粘在膠帶上，用離子濺射儀對樣品

7、表面噴鍍導(dǎo)電薄層（厚度約10nm），準(zhǔn)備在掃描電鏡下觀察。（2） 開啟掃描電鏡真空系統(tǒng)電源，等待真空度達到工作狀態(tài)（正常情況下約需30min）。（3） 開啟掃描電鏡鏡筒電源。（4） 將樣品置入電鏡。（5） 對于熱發(fā)射鎢燈絲掃描電鏡，加高壓至1520kV。（6） 加燈絲電流至飽和點。（7） 在低放大倍數(shù)（數(shù)十倍）下， 尋找樣品感興趣區(qū)。根據(jù)樣品特性和感興趣區(qū)大小，選取適當(dāng)?shù)墓ぷ骶嚯x與放大倍數(shù)，調(diào)節(jié)亮度與對比度，聚焦，校正像散，然后進行照相記錄即可。（8） 關(guān)機【實驗結(jié)果】 本次實驗我們用掃描電鏡對百合花粉粒進行觀察并拍照記錄，圖一、圖二是我們班級的一些實驗照片。圖一 百合花粉粒掃描電子

8、顯微鏡像圖二 百合花粉粒掃描電子顯微鏡像【討論】思考題1、二次電子像的襯度與樣品的何種特征有關(guān)？二次電子的產(chǎn)率定義為二次電子數(shù)與入射電子數(shù)之間的比值，并且1cos，為入射電子束與樣品表面法線之間的夾角。由于樣品表面不是平整的，各點的值與值不同，即樣品表面各點的二次電子信號強度不同。因此二次電子像的襯度反應(yīng)樣品表面幾何形貌。此外，由于入射電子束孔徑角很小，二次電子像還具有景深大，立體感強的特點。2、為什么臨界點干燥可以避免自然干燥對生物樣品表面形貌的損傷？臨界點干燥的原理是：在一定的溫度和壓力下，物質(zhì)的液態(tài)和氣態(tài)界面將會消失，液態(tài)瞬間轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，形成非液非固的狀態(tài)，即達到臨界點（C.P）狀態(tài)。在臨界點時，表面張力消失，分子間的內(nèi)聚力等于零，而在顯微尺度上，表面張力對生物材料形態(tài)的影響十分強大。表面張力是存在于固-液、液-氣界面上的主要物理力之一。液-氣界面上表面張力的作用是造成生物樣品收縮的主要原因。因此，利用臨界點狀態(tài)對材料進行干燥，材料理論上不會產(chǎn)生收縮和形變，對于質(zhì)地較軟的材料這種方法是最好的干燥方法。3、生物樣品在掃描電鏡觀察前為什么要進行金屬噴漆處理？由于生物樣品導(dǎo)電性低，未經(jīng)過導(dǎo)電處理的樣品在掃描電鏡下觀察時會產(chǎn)生荷電現(xiàn)象，從而影響觀察和