ELISA試劑及溶液配制及試驗(yàn)步驟

1、ELISA試劑及溶液配制包被液：0.05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.6）0.75g碳酸鈉,1.46g碳酸氫鈉，加去離子水定容至500ml。0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）0.2g磷酸二氫鉀，2.90g磷酸氫二鈉，8g氯化鈉，加去離子水定容到 1000ml。抗體稀釋液：0.02mol/L PBS（pH7.4）+0.2%BSA0.2gBSAffl配好的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液溶解定量至100g。封閉液：0.05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.6）+2.0%BSA2.0gBSAffl配好的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液溶解定量至100g。洗滌液：0.02mol/L PBS（pH

2、7.4）+0.05%Tween-20將50ulTween-20溶入100ml0.02mol/L磷酸鹽緩沖液中，震蕩混 勻。顯色液：TMB過(guò)氧化氫尿素溶液A液（3, 3' , 5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺，TMB）:稱取TMB20m瓣于 10ml無(wú)水乙醇中，完全溶解后，加雙蒸水至100ml。B液（0.1mol/L檸檬酸-0.2mol/L磷酸氫二鈉緩沖液，pH5.0-5.4）: 稱取NaHPO12HO14.34g,檸檬酸1.87g溶于180ml雙蒸水，加0.75% 過(guò)氧化氫尿素1.28ml,定容至200ml,調(diào)pH至5.0-5.4。將A液和B液按1: l混合后即成TMB過(guò)氧化氫尿素應(yīng)用

3、液。終止液：2mol/L H 2SO溶液10ml98麻硫酸加入60ml雙蒸水中，定容至100ml,室溫保存。酶標(biāo)二抗：HR刖記的羊抗兔IgG ,應(yīng)用時(shí)用抗體稀釋液稀釋3000 倍。2.2.6抗血清的分離采集血液后，去掉針頭，緩慢注入已經(jīng)滅菌的三角燒瓶中，待凝 固后用滅菌滴管將血液沿邊緣剝離，室溫放置1小時(shí)，再放入4c冰箱過(guò)夜（不能冰凍，否則產(chǎn)生溶血），使血清充分析出。第二天取出后 以4c3000r/min離心30min,取上清，分裝后-20 C保存?zhèn)溆谩?.2.7間接ELISA法檢測(cè)家兔抗血清效價(jià)（1）抗原包被用包被液（0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，pH9.6）把抗原稀釋為 0.01mg/

4、ml,將稀釋好的抗原液于每個(gè)酶標(biāo)板孔中加入100膜。把酶標(biāo)板置入濕盒內(nèi)，于4 c包被過(guò)夜。（2）洗板棄去包被液，用洗滌液加滿所有酶標(biāo)孔，用紗布和衛(wèi)生紙包住扣 干。1次，末次將水扣干。封閉在酶聯(lián)板上每孔加入250膜 封閉液（pH9.6 , 0.05mol/L碳酸 鹽緩沖液含2.0%BSA）將酶聯(lián)板置于濕盒內(nèi)，4c孵育過(guò)夜。也可37C 孵育2h。棄去封閉液，洗滌1次同上。（5）加一抗（家兔抗血清）將免疫小鼠抗血清10屋 加到990” 的抗體稀釋液中制成 1:100的抗血清。（于1.5ml的EP管中操作）。給酶標(biāo)板上A行的1 號(hào)孔加100履 的1:100的血清。給酶標(biāo)板上A行的2到12孔各加入 抗體

5、稀釋液100 ”,然后給A組的第二孔加入100屋1:100的抗 血清，吹吸十次后吸取100 w l的血清加到第三孔，再吹吸十次取100 “加到第四孔，依次加到第12孔，最后從第十二孔中吸出100” 舍棄。這樣每孔均為100屋，經(jīng)過(guò)11次二倍稀釋，血清稀釋度為 1:204800。B、C行同上操作。給D行的前兩個(gè)孔只加入100w l的抗體稀釋液做為空白對(duì)照， 3-4孔加入100”稀釋100倍的陰性血，5-6孔不加抗原，只用封閉 液封閉，每孔加入100”稀釋100倍的抗血清作對(duì)照。加完后將酶 連板放在濕盒內(nèi)37c孵育1h。(6)洗滌同上。(7)加酶標(biāo)二抗各孔加入稀釋倍數(shù)為1:3000的酶標(biāo)二抗(羊抗兔)100“，37 C 濕盒內(nèi)孵育1h。洗滌同上(9)顯色每孔各加A, B液50晨 后將酶連板放入濕盒內(nèi)避光 3min左右， 當(dāng)陰性對(duì)照孔顯藍(lán)綠色時(shí)終止。終止時(shí)每孔加入 50”的2mol/L濃 硫