調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Treg及其流式檢測(cè)

1、調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞Treg及其流式檢測(cè)方法1、Treg細(xì)胞概述高效免疫抑制劑的發(fā)現(xiàn)及其聯(lián)合應(yīng)用使臨床器官移植的急性排斥反響大大 降低,移植物的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)；器官移植成為挽救終末期器官功能衰竭患者 生命的重要有效途徑。但是免疫抑制劑具有明顯的蠹副作用如對(duì)重要臟器的損傷、降低抗腫瘤及抗感染免疫力等及對(duì)治療慢性排斥反響效果較差等問題，均 限制了免疫抑制劑的長(zhǎng)期應(yīng)用。因此，相關(guān)生命科學(xué)工作者嘗試通過誘導(dǎo)移植免 疫耐受途徑來防止免疫抑制劑的長(zhǎng)期應(yīng)用及克服移植免疫排斥反響。在上個(gè)世紀(jì)九十年代中期，由 Sakaguchi等首先證實(shí)了天然 CD4 CD25 調(diào)節(jié) 性 T 細(xì)胞regulatory T cell

2、 ,Treg為一類具有免疫抑制作用的 T細(xì)胞，約占 外周 CD4+T!田胞的 510%該類細(xì)胞以“主動(dòng)的方式參與免疫應(yīng)答/免疫耐 受的調(diào)控，不僅參與自身免疫耐受調(diào)節(jié)，而且在腫瘤免疫和移植免疫中也具有重 要的作用。2、Treg細(xì)胞的來源研究證實(shí)，天然的 CD4 +CD25+Tre卵胞來源于胸腺，小鼠出生后第 3 天切 除胸腺，外周缺乏 CD4+ CD25+Tregffl胞，產(chǎn)生抗自身抗體并出現(xiàn)自身免疫性胃 炎等自身免疫性疾病。而在第 0 天和第 7天切除胸腺，并不表現(xiàn)自身免疫性疾病。 這說明出生 3d內(nèi)是胸腺產(chǎn)生 CD4+CD25+Treg田胞的關(guān)鍵時(shí)期，這時(shí)切除胸腺引 起自身反響性 CD4+T

3、!田胞的過度增殖。但是，出生第 0 天胸腺產(chǎn)生的自身反響性 CD4+TS胞缺乏，出生第 7 天胸腺已經(jīng)產(chǎn)生了足夠的 CD4+CD25+Treg田胞，所以 這時(shí)切除胸腺，小鼠不出現(xiàn)自身免疫性疾病。Papiernik 等證實(shí)，CD4+CD25+Treg 細(xì)胞產(chǎn)生于胸腺，然后遷移到外周發(fā)揮作用，CD4+CD 25 匈腺細(xì)胞與外周的CD4+CD25+Tre細(xì)胞一樣，表現(xiàn)對(duì)經(jīng)由 TCR 的抗原刺激呈低反響性，并且顯示抑 制其他 T細(xì)胞增殖的能力。CD4+CD25+ Tre#田胞的產(chǎn)生需要 TCR 與胸腺皮質(zhì)上 皮細(xì)胞的MHC II 類分子間的高親和力作用， MHC II 類分子缺陷的小鼠缺乏 CD4+C

4、D25+Tre細(xì)胞。CD4+CD25+T 胞除了在胸腺產(chǎn)生以外，還可以在未成熟的 樹突狀細(xì)胞、IL-10、IFN-a、TGF-beta或者低劑量抗原誘導(dǎo)下由外周 CD4+CD25- 細(xì)胞轉(zhuǎn)變而來，該類細(xì)胞稱為誘導(dǎo)的 CD4+CD25+Tre細(xì)胞。3、Treg細(xì)胞的常用的分子標(biāo)記CD25 Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)平衡，增加免疫耐受。研究說明，多種 T細(xì)胞分子抗原參與 Treg 細(xì)胞的特異性功能效應(yīng)。傳統(tǒng)鑒定 Treg 細(xì)胞主要是通過 CD 斯日 CD25標(biāo)記。但隨著研究的進(jìn)一步深入，覺察只通過 CD4+CD25+陽(yáng)性來 定義的 Treg細(xì)胞并不完全準(zhǔn)確FOXP3 FOX(forkhead b

5、ox)是脊椎動(dòng)物義頭樣 轉(zhuǎn)錄因子的總稱，是一個(gè)具有多種功能的轉(zhuǎn)錄因子大家族， 通常和細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育 的調(diào)控有關(guān)。FOX 家族成員都有一個(gè)義頭樣結(jié)構(gòu)域，能與 DNA 吉合。FOXP3!義 頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員，2001年由 Brunkow等首次報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，它的 表達(dá)及 功能與調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞(regulatoryT cells,TR 細(xì)胞)密切相關(guān)。如果 FOXP3 基因發(fā)生突變，將影響 TR細(xì)胞的發(fā)育成熟，導(dǎo)致 IPEX 綜 合 征 (immune dysregulation , polyendocrinop -athy , enteropathy , X linkedsyndrome)

6、 。 FOXP3 主要表達(dá)于胸腺、脾臟和淋巴結(jié)等淋巴器官和組織。在小鼠特異性表達(dá) 于 CD4+CD25+T 胞，而不表達(dá)于 CD8+TS 胞。在人類 FOXP%僅可表達(dá)于CD4+CD25+T 胞，還可表達(dá)于 CD8+CD28-T 田胞。但在 CD4+TM 胞中的表達(dá)明顯 高于 CD8+HH 胞。目前，F(xiàn)oxp3(forkhead box P3 , Scurfin)是目前公認(rèn)的 Treg 細(xì)胞的最敏感的標(biāo)志。CD127 最近發(fā)現(xiàn)通過表達(dá) CD4 CD25 和傳導(dǎo)信號(hào) FoxP3 來定義調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞時(shí)，在一類特殊的細(xì)胞群體時(shí)會(huì)出現(xiàn)問題。我們發(fā)現(xiàn)IL-7受體(CD127 在外周血 CD4+T勺一

7、個(gè)業(yè)群中會(huì)下調(diào)表達(dá)。我們證實(shí)這些細(xì)胞 FoxP3 陽(yáng)性，且這 群細(xì)胞包括那些 CD2 弱馬陽(yáng)性或陰性群體。聯(lián)合使用 CD4 CD25W CD127 可得到 高純度的調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞，比以前的通過其他標(biāo)志物來區(qū)分方法顯著提高。這些 細(xì)胞在功能抑制實(shí)驗(yàn)中可發(fā)揮高度抑制功能。實(shí)際上，通過 CD砌 CD127S達(dá)來區(qū)分的細(xì)胞 數(shù)量(包括 CD25+CD4+ CD25-CD4+三倍于通過 CD4+CD25h 區(qū)分 的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞業(yè)群。 最后， 我們使用 CD127定量檢測(cè)I型糖尿病病人調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞， 發(fā)現(xiàn)CD127W作為人調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞的標(biāo)志物。4、FOXP毓式檢測(cè)方法美國(guó) eBioscience公司是

8、最早擁有 FOXP 毓式檢測(cè)抗體的公司之一，公司通 過不斷改良和優(yōu)化，建立了一套完美的針對(duì)FOXP3K 式檢測(cè)特殊的試劑和方案。(1) 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)設(shè)備1)流式上樣管2)混勻振蕩器3)離心機(jī)4)移液器、Tips5)流式細(xì)胞儀所需試劑1)細(xì)胞外表染色的熒光標(biāo)記的單抗試劑(CD4CD2 眥 CD8 等)2)FOXP 欲光標(biāo)記抗體3)溶血素：(eBioscience目錄號(hào) 00-4333)用于裂解紅細(xì)胞淋巴細(xì)胞別離液：假設(shè)樣品為人的全血，建議先用別離液別離出單個(gè)核細(xì)胞后再做 后續(xù)檢測(cè)5)固定劑和破膜劑： (eBioscienceFOXP 齡測(cè)專用試劑， 目錄號(hào)為 00-5521或 00-5523;在

9、 FOXP疑色前，將其中的 Fixation/Perme -abilization Concentrate 和Fixation/Permeabilization Diluent 以 1: 3 的比例混合，配 制好的溶液保存時(shí)間不要超過一天)6)其他試劑：Flow Cytometry Staining Buffer (00-4222)或 PBS Permeabil -izationBuffer (Cat.No 00-8333 )等(2)實(shí)驗(yàn)操作步驟注：對(duì)于不同的 FOXP3S隆號(hào)抗體，在操作上可能存在著一些細(xì)微的差異。具體實(shí)驗(yàn)時(shí)，請(qǐng)參考相應(yīng)的抗體說明書上的操作步驟。此操作以人 Foxp3 (cl

10、onePCH101, cat. XX-4776). 為例。1)在每個(gè)流式上樣管中參加 100ul 準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸:液，細(xì)胞數(shù)約為 1x106個(gè)。2)按照細(xì)胞外表抗原染色方法標(biāo)記外表抗原(如 CD4 CD8 CD25)。3)用預(yù)冷的 Flow Cytometry Staining Buffer或預(yù)冷的 PBS洗滌細(xì)胞。4)旋渦震蕩重懸細(xì)胞后參加 1ml 的固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization ),并再次旋渦混勻。5)避光 4C 孵育 30-60 分鐘。6)參加 2ml Permeabilization Buffer (Cat.No 00-8333 )工作液離心洗滌細(xì)胞并棄去上活液。7)重復(fù)第 5步操作洗滌細(xì)胞。8)可選參加稀釋好的 2% (2ul )的正常大鼠血活(用 Permeabilization Buffer工作液進(jìn)行稀釋)100ul,在避光 4C 孵育 15分鐘9)封閉液無需洗去，直接參加稀釋好的熒光標(biāo)記FOXP3%體(用Permeabilization Buffer工作液進(jìn)行稀釋)20ul ,避光 4C 孵育至少 30 分鐘。建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出抗體的最適濃度。10)參加 2ml Permeabilization B