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文檔簡介
1、 專題1 基因工程 基因拼接的理論基礎(chǔ) (1)大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)是DNA。 (2)DNA的基本組成單位都是四種脫氧核苷酸。 (3)雙鏈DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)外源基因在受體內(nèi)表達的理論基礎(chǔ) (1)基因是控制生物性狀的獨立遺傳單位。 (2)遺傳信息的傳遞都遵循中心法則。 (3)生物界共用一套遺傳密碼。 基因工程的概念 基因工程是指按照人們的愿望,進行嚴格的設(shè)計,通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù),賦予生物以 新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品?;蚬こ淌窃贒NA分子水平上進 行設(shè)計和施工的,又叫做DNA重組技術(shù)。 (一)基因工程的基本工具 1.“分子手術(shù)刀”
2、限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶) (1)來源:主要是從原核生物中分離純化出來的。 (2)功能:能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列,并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷 酸之間的磷酸二酯鍵斷開,因此具有專一性。 (3)結(jié)果:經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式:黏性末端和平末端。 2.“分子縫合針”DNA連接酶 (1)兩種DNA連接酶(EcoliDNA連接酶和TDNA連接酶)的比較: 4-相同點:都縫合磷酸二酯鍵。 區(qū)別:EcoliDNA連接酶來源于大腸桿菌,只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵 連接起來;而TDNA連接酶來源T4噬菌體,能縫合兩種末端,但連接平末端的之
3、間的效率較4 低。 (2)與DNA聚合酶作用的異同:DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端,形成磷酸二 酯鍵。DNA連接酶是連接兩個DNA片段的末端,形成磷酸二酯鍵。 3.“分子運輸車”載體 (1)載體具備的條件:能在受體細胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存。 具有一至多個限制酶切點,供外源DNA片段插入。 具有標記基因,供重組DNA的鑒定和選擇。 (2)最常用的載體是質(zhì)粒,它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨立于細菌擬核之外,并具有自我復(fù)制能 力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。 (3)其它載體: 入 噬菌體的衍生物、動植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 第一步:目的基因的獲取 1.目的基因是指: 編碼蛋
4、白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因 和某些具有調(diào)控作用的因子。 2.原核基因采取直接分離(從基因文庫中獲?。┇@得,真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常 用方法有反轉(zhuǎn)錄法_和化學(xué)合成法_。 3.PCR技術(shù)擴增目的基因 (1)原理:DNA雙鏈復(fù)制 (2)過程:第一步:加熱至9095DNA解鏈;第二步:冷卻到5560,引物結(jié)合到互補DNA鏈; 第三步:加熱至7075,熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補鏈的合成。 (3)條件:模板,引物,熱穩(wěn)定DNA聚合酶(taqDNA聚合酶) 第二步:基因表達載體的構(gòu)建(基因工程中的最關(guān)鍵步驟) 1.目的:使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳至下一代,使目的基因能夠表達和發(fā)揮
5、作 用。 2.組成:目的基因啟動子終止子標記基因 (1)啟動子:是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段,位于基因的首端,是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位,能 驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA,最終獲得所需的蛋白質(zhì)。 1 ,位于基因的 尾端。(2)終止子:也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段篩選出含有目的基因的細胞)標記基因的作用:是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因,從而將(3 。常用的標記基因是抗生素基因。來(鑒定和篩選含有目的基因的受體細胞) 第三步:將目的基因?qū)胧荏w細胞_ 是目的基因進入受體細胞內(nèi),并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。1.轉(zhuǎn)化的概念: 常用的轉(zhuǎn)化方法:2. 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,其次還有 基因槍法和 將
6、目的基因?qū)胫参锛毎翰捎米疃嗟姆椒ㄊ腔ǚ酃芡ǖ婪ǖ取?T-DNA上作用:將目的基因?qū)氲绞荏w細胞并整合到染色體DNA 顯微注射技術(shù)。此方法的受體細胞多是將目的基因?qū)雱游锛毎鹤畛S玫姆椒ㄊ鞘芫?。繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對較 將目的基因?qū)胛⑸锛毎涸松镒鳛槭荏w細胞的原因是 感受態(tài)細胞少 ,處理細胞,使其成為最常用的原核細胞是 大腸桿菌 ,其轉(zhuǎn)化方法是:先用 CaCl 2溶于緩沖液中分子 )(原因是:未經(jīng)處理的細胞不能從外界環(huán)境中吸收DNA,再將 重組表達載體DNA 分子,完成轉(zhuǎn)化過程。與感受態(tài)細胞混合,在一定的溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA 。的依據(jù)是標記基因是否表達3.重
7、組細胞導(dǎo)入受體細胞后,篩選含有基因表達載體受體細胞 目的基因的檢測和表達第四步:(原理,方法是采用 DNA1.DNA首先要檢測 轉(zhuǎn)基因生物的染色體上是否插入了目的基因分子雜交技術(shù) 。是:堿基互補配對原則)D,方法是采用 用標記的目的基因作探針與2.其次還要檢測 mRNA 目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了雜交(mRNA NA-RNA分子雜交技術(shù),原理是:堿基互補配對原則)。抗,用相應(yīng)的,方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取 蛋白質(zhì) 進行3.最后檢測抗體 目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì) 原抗體雜交。 轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否出現(xiàn)抗蟲性狀。 4.有時還需進行 個體生物學(xué)水平的鑒定。如 (三)基因工程的應(yīng)用 抗蟲、抗病、抗逆轉(zhuǎn)基因植物,
8、利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)。1.植物基因工程: 提高動物生長速度、改善畜產(chǎn)品品質(zhì)、用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物。2.動物基因工程: 把正常的外源基因?qū)氩∪梭w內(nèi),使該基因表達產(chǎn)物發(fā)揮作用。3.基因治療: (四)蛋白質(zhì)工程的概念,基因修飾或基因合成蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ),通過(基因工程在原則,對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造或制造一種新的蛋白質(zhì),以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。 上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)) 轉(zhuǎn)錄 翻譯 專 細胞工程題2 (一)植物細胞工程 理論基礎(chǔ)(原理):細胞全能性1. 受精卵生殖細胞干細胞體細胞;植物細胞動物細胞全能性表達的難易程度:2.植物組織培養(yǎng)技術(shù)
9、 (1)過程:離體的植物器官、組織或細胞 (2)用途:微型繁殖(繁殖速度快,能保持親本的遺傳性狀)、作物脫毒(選擇植物根尖和莖尖,因為它們不含毒)、制造人工種子、單倍體育種、細胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)。 (3)地位:是培育轉(zhuǎn)基因植物、植物體細胞雜交培育植物新品種的最后一道工序。 3.植物體細胞雜交技術(shù) (1)過程: 2 (纖維素酶和果膠酶) P聚乙二醇(2)誘導(dǎo)融合的方法:物理法包括離心、振動、電刺激等?;瘜W(xué)法一般是用(融合成功標志:新細胞)意義:作為誘導(dǎo)劑。(3(4)克服了遠緣雜交不親和的障礙。EG) 壁的形成 (二)動物細胞工程 動物細胞培養(yǎng) 1. ,然組織,將它分散成1)概念:動物細胞培養(yǎng)就是
10、從動物機體中取出相關(guān)的(單個細胞 后放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細胞生長和繁殖。)()動物細胞培養(yǎng)的流程:取動物組織塊(健康的動物胚胎或幼齡動物的器官或組織2轉(zhuǎn)入培養(yǎng)處理分散成剪碎用胰蛋白酶或膠原蛋白酶單個細胞制成細胞懸液培養(yǎng)貼滿瓶壁的細胞重新用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個瓶中進行原代 傳代培養(yǎng)。細胞繼續(xù)。細細胞貼壁3()細胞貼壁和接觸抑制:懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上,稱為,時,細胞就會停止分裂增殖胞數(shù)目不斷增多,當(dāng)貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸 。這種現(xiàn)象稱為細胞的接觸抑制 (4)動物細胞培養(yǎng)需要滿足以下條件,無菌、無毒的環(huán)境:培養(yǎng)液應(yīng)進行無菌抗生素處理。通常還要在培養(yǎng)液中添加一
11、定量的代謝產(chǎn)物以防培養(yǎng)過程中的污染。此外,應(yīng)定期更換培養(yǎng)液,防止 積累對細胞自身造成危害。:合成培養(yǎng)基成分:糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素等。通常需加入營養(yǎng) 等天然成分(原因是人們對細胞所需要的營養(yǎng)物質(zhì)還不完全清楚)。血清、血漿 溫度:適宜溫度:哺乳動物多是36.50.57.4。:7.2;pH 。pH的主要作用是空氣5%。COO是細胞代謝所必需的,CO:氣體環(huán)境95%維持培養(yǎng)液的222制備病毒疫苗、制備單克隆抗體、檢測有毒物質(zhì)、培養(yǎng))動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用:(5 醫(yī)學(xué)研究的各種細胞。 動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物(原理是:細胞核的全能性)2. 體細胞胚胎細胞(1核移植(比較容易)和
12、)哺乳動物核移植可以分為核移植(比較難)。細胞質(zhì)多,)細胞比較大,容易操作;卵(母細胞的原因:卵((2)選用去核卵母)細胞(母) 。營養(yǎng)豐富 (右圖)(3)體細胞核移植的大致過程是: 核移植 胚胎移植 3 (4)體細胞核移植技術(shù)的應(yīng)用: 加速家畜遺傳改良進程,促進良畜群繁育; 保護瀕危物種,增大存活數(shù)量; 生產(chǎn)珍貴的醫(yī)用蛋白; 作為異種移植的供體; 用于組織器官的移植等。 (5)體細胞核移植技術(shù)存在的問題: 克隆動物存在著健康問題、表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷等。 3.動物細胞融合 (1)動物細胞融合也稱細胞雜交,是指兩個或多個動物細胞結(jié)合形成一個細胞的過程。 融合后形成的具有原來兩個或多個細胞遺傳信
13、息的單核細胞,稱為雜交細胞。 (2)動物細胞融合與植物原生質(zhì)體融合的原理基本相同,誘導(dǎo)動物細胞融合的方法與植物原生質(zhì)體融合的方法類似,常用的誘導(dǎo)因素有聚乙二醇、滅活的病毒、電刺激等。 (3)動物細胞融合的意義:克服了遠緣雜交的不親和性,成為研究細胞遺傳、細胞免疫、 腫瘤和生物新品種培育的重要手段。 (4)動物細胞融合與植物體細胞雜交的比較: 比較項目 細胞融合的原理 細胞融合的方法 誘導(dǎo)手段 用法 植物體細胞雜交 細胞膜的流動性 去除細胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合 離心、電刺激、振動,聚乙二醇等試劑誘導(dǎo) 克服了遠緣雜交的不親和性,獲得雜種植株 動物細胞融合 細胞膜的流動性 使細胞分散后誘導(dǎo)細胞融合
14、除應(yīng)用植物細胞雜交手段外,再加滅活的病毒誘導(dǎo) 制備單克隆抗體的技術(shù)之一 4.單克隆抗體 (1)抗體:一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體。從血清中分離出的抗體產(chǎn)量低、純 度低、特異性差。 (2)單克隆抗體的制備過程: 抗原注入小鼠體內(nèi) 分離 B淋巴細胞 骨髓瘤細胞 細胞融合 雜交瘤細胞 細胞培 選擇培養(yǎng)細胞 注入小培養(yǎng) 體內(nèi)培養(yǎng) 體外培養(yǎng) 從腹水提取 從培養(yǎng)液提 單克隆抗體 (3)雜交瘤細胞的特點:既能大量繁殖,又能產(chǎn)生專一的抗體。 4 (4)單克隆抗體的優(yōu)點:特異性強,靈敏度高,并能大量制備。 (5)單克隆抗體的作用: 作為診斷試劑:準確識別各種抗原物質(zhì)的細微差異,并跟一定抗原發(fā)生特異性結(jié)合,
15、 具有準確、高效、簡易、快速的優(yōu)點。 用于治療疾病和運載藥物:主要用于治療癌癥治療,可制成“生物導(dǎo)彈”,也有少量 用于治療其它疾病。 專題3 胚胎工程 1概念、胚胎工程是指對動物早期胚胎或配子所進行的多種顯微操作和處理技術(shù),如胚胎移植、體外受精、胚胎分割、胚胎干細胞培養(yǎng)等技術(shù)。經(jīng)過處理后獲得的胚胎,還需移植到雌性動物體內(nèi)生產(chǎn)后代,以滿足人類的各種需求。 2、動物胚胎發(fā)育的基本過程 (1)精子的發(fā)生:補充,精原細胞先進行有絲分裂后進行減數(shù)分裂;變形過程中,細胞核為精子頭的主要部分,高爾基體發(fā)育為頂體,中心體演變?yōu)榫拥奈玻€粒體在尾基部形成線粒體鞘膜,其他物質(zhì)濃縮為原生質(zhì)滴直至脫落。線粒體為精子
16、運動提供能量 (2)卵子的發(fā)生:在胎兒時期,卵原細胞進行有絲分裂演變成初級卵母細胞被卵泡細胞包圍,減一分裂在排卵前后完成,形成次級卵母細胞和第一極體進入輸卵管準備受精;減二分裂是在受精過程中完成的。 (3)受精:精子獲能(在雌性動物生殖道內(nèi));卵子的準備(排出的卵子要在輸卵管中進一步成熟到減二中期才具備受精能力);受精階段卵子周圍的結(jié)構(gòu)由外到內(nèi):放射冠、透明帶、卵黃膜,a頂體反應(yīng):精子釋放頂體酶溶解卵丘細胞之間的物質(zhì),穿越放射冠。 b透明帶反應(yīng):頂體酶可將透明帶溶出孔道,精子穿入,在精子觸及卵黃膜的瞬間阻止后來精子進入透明帶的生理反應(yīng)它是防止多精子入卵受精的第一道屏障;c卵細胞膜的封閉作用:精
17、子外膜和卵黃膜融合,精子入卵后,卵黃膜會拒絕其他精子再進入卵內(nèi)的過程它是防止多精子入卵受精的第二道屏障;精子尾部脫落,原有核膜破裂形成雄原核,同時卵子完成減二分裂,形成雌原核注意:受精標志是第二極體的形成;受精完成標志是雌雄原核融合成合子。 (1)受精場所是母體的輸卵管。 (2)胚胎發(fā)育:a卵裂期:細胞進行有絲分裂,數(shù)量增加,胚胎總體積不增加;b桑椹胚:32個細胞左右的胚胎之前所有細胞都能發(fā)育成完整胚胎的潛能屬全能細胞;c囊胚:細胞開始分化,其中個體較大的細胞叫內(nèi)細胞團將來發(fā)育成胎兒的各種組織;而滋養(yǎng)層細胞將來發(fā)育成胎膜和胎盤;胚胎內(nèi)部逐漸出現(xiàn)囊胚腔注:囊胚的擴大會導(dǎo)致透明帶的破裂,胚胎伸展出
18、來,這一過程叫孵化;d原腸胚:內(nèi)細胞團表層形成外胚層,下方細胞形成內(nèi)胚層,由內(nèi)胚層包圍的囊腔叫原腸腔。細胞分化在胚胎期達到最大限度 (三)胚胎工程的應(yīng)用 1.體外受精和胚胎的早期培養(yǎng) (1)卵母細胞的采集和培養(yǎng):主要方法:用促性腺激素處理,使其排出更多的卵子,然后,從輸卵管中沖取卵子,直接與獲能的精子在體外受精。第二種方法:從剛屠宰母畜的卵巢中采集卵母細胞;第三種方法是借助超聲波探測儀、腹腔鏡等直接從活體動物的卵巢中吸取卵母細胞。采集的卵母細胞,都要在體外經(jīng)人工培養(yǎng)成熟后,才能與獲能的精子受精。 5 b精子的采集 假陰道法、手握法和電刺激法;獲能 對嚙齒動物、兔、豬等的精子用培養(yǎng)法(放入人工配
19、制的獲能液中);對牛、羊等精子用化學(xué)法(放在肝素或鈣離子載體溶液中) (3) 受精(屬于有性生殖):獲能的精子和培養(yǎng)成熟的卵細胞在獲能溶液或?qū)S玫氖芫芤褐型瓿墒芫^程。 (4)胚胎的早期培養(yǎng):精子與卵子在體外受精后,應(yīng)將受精卵移入發(fā)育培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng),以檢查受精狀況和受精卵的發(fā)育能力。培養(yǎng)液成分較復(fù)雜,除一些無機鹽和有機鹽外,還需添加維生素、激素、氨基酸、核苷酸等營養(yǎng)成分,以及血清等物質(zhì)。當(dāng)胚胎發(fā)育到適宜的階段時,可將其取出向受體移植或冷凍保存。不同動物胚胎移植的時間不同。(牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚階段才能進行移植,小鼠、家兔等實驗動物可在更早的階段移植,人的體外受精胚胎可在4個細胞階
20、段移植。) 2.胚胎移植(1胚胎移植是指將雌性動物的早期胚胎,或者通過體外受精及其它方式得到的胚胎,植同種的、生理狀態(tài)相同其它雌性動物的體內(nèi),使之繼續(xù)發(fā)育為新個體的技術(shù)。其提供胚胎的個體稱供,接受胚胎的個體稱受(供體優(yōu)品種,作為受的雌性動物應(yīng)常見或存量的品種。地位:轉(zhuǎn)基因、核移植,或體外受等任何一項胚胎工程技術(shù)所生產(chǎn)的胚胎,都必須胚胎移植技才能獲得后代,胚胎工程的最后一工(2)胚胎移植的意義:大大縮短供體本身的繁殖周,充分發(fā)雌性優(yōu)良個體的繁殖(3)生理學(xué)基礎(chǔ):動物發(fā)情排卵后,同種動物的供、受體具有相同的生理環(huán)境,這就供體的胚胎移入受體提供相同的生理環(huán)早期胚胎在不與母體子宮建立組織上的聯(lián)系。這就
21、胚胎的收集提供了可受體對移入子宮的外來胚胎不發(fā)免疫排斥反。這胚胎在受體的存活提供了可受體不會改變外來胚胎的遺傳性(4)基本程序主要包括對供、受體的選擇和處。選遺傳特性和生產(chǎn)性優(yōu)秀的供體,健康的體質(zhì)和正繁殖能的受體,供體和受體同物種。并用激素(性激素:孕激素)進同期發(fā)情,促性腺激對供體母牛超數(shù)排處理配種或人工授對胚胎的收集、檢查、培養(yǎng)或保。配種或輸精后天,用特制沖裝置,把供母牛子宮內(nèi)胚沖洗出也叫沖。對胚胎進質(zhì)檢查,此時的胚胎應(yīng)發(fā)育?;蚺吣译A段。直接向受體移植或放19的液中保存胚進行移植移植后的檢查。對受體母牛進是否妊的檢查3胚胎分 6 (1)概念:是指采用機械方法將早期胚胎切割2等份、4等份等,
22、經(jīng)移植獲得同卵雙胎或多胎的技術(shù)。 (2)意義:來自同一胚胎的后代具有相同的遺傳物質(zhì),屬于無性繁殖。 (3)材料:發(fā)育良好,形態(tài)正常的桑椹胚或囊胚。(桑椹胚至囊胚的發(fā)育過程中,細胞開始分化,但其全能性仍很高,也可用于胚胎分割。) (4)操作過程:對囊胚階段的胚胎分割時,要將內(nèi)細胞團均等分割,否則會影響分割后胚胎的恢復(fù)和進一步發(fā)育。 (二)胚胎干細胞 1、哺乳動物的胚胎干細胞簡稱ES或EK細胞,來源于早期胚胎或從原始性腺中分離出來。 2、具有胚胎細胞的特性,在形態(tài)上表現(xiàn)為體積小,細胞核大,核仁明顯;在功能上,具有發(fā)育的全能性,可分化為成年動物體內(nèi)任何一種組織細胞。另外,在體外培養(yǎng)的條件下可增而不發(fā)分,可進冷保存,也可進遺傳改、胚胎干細胞的主要用途是:可用于研究哺乳動個體發(fā)生和發(fā)育規(guī);是在體條件下研細胞分的理想材料在培養(yǎng)液中加分化誘導(dǎo)因如牛黃酸等化學(xué)物質(zhì)時就可以誘E細胞向不同類型的組
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