HPLC安捷倫高效液相使用維護常見問題

1、 HPLC HPLC的使用、維護及方法學的建立的使用、維護及方法學的建立藥劑教研室藥劑教研室 馬冬冬馬冬冬2HPLCHPLC基本原理和特點基本原理和特點液相色譜儀器部件液相色譜儀器部件實驗操作與應用實驗操作與應用日常維護日常維護方法學的建立方法學的建立基本原理和特點基本原理和特點基本原理：溶于流動相基本原理：溶于流動相(mobile phase)(mobile phase)中的各組分經(jīng)過固定中的各組分經(jīng)過固定相時，由于與固定相相時，由于與固定相(stationary phase)(stationary phase)發(fā)生作用發(fā)生作用( (吸附吸附，分分配配，離子吸引離子吸引，排阻排阻，親和親和)

2、 )的大小的大小，強弱不同強弱不同，在固定相中在固定相中滯留時間不同滯留時間不同，從而先后從固定相中流出從而先后從固定相中流出。特點：分離效率高、分析速度快、應用范圍廣、操作自動化。特點：分離效率高、分析速度快、應用范圍廣、操作自動化。HPLCHPLC的分類的分類按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。正相色譜法：采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（如正已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃等以調(diào)節(jié)組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物。反相色譜法反相色譜法：一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相

3、為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑，極性物質(zhì)先出極性物質(zhì)先出。高效液相色譜儀組成高效液相色譜儀組成輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng) 溶劑溶劑 色譜泵自動進樣器 HPLC色譜柱色譜柱檢測器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)液相色譜流程圖液相色譜流程圖一些商品化儀器一些商品化儀器脫氣裝置四元泵柱溫箱樣品盤檢測器流動相溶劑溶劑棕色玻璃瓶會避免藻類的生長。棕色玻璃瓶會避免藻類的生長。經(jīng)常過濾溶劑以免其中微粒永久性阻塞毛細管。經(jīng)常過濾溶劑以免其中微粒永久性阻塞毛細管。啟動液相色譜儀器的流程啟動液相色譜儀器的流程 l開啟

4、開啟HPLC系統(tǒng)各個設備的電源系統(tǒng)各個設備的電源打開泵、自動進樣器、檢測器電源，打開計算機啟動“1260聯(lián)機工作站”，待工作站圖形顏色為綠色表明儀器已就緒。l排氣泡排氣泡打開排氣閥，將流速調(diào)至5ml/min，排氣5min；待流速降為0，擰緊排氣閥。l80%甲醇（過濾、超聲甲醇（過濾、超聲15min）沖洗系統(tǒng)）沖洗系統(tǒng)使用80%的甲醇溶液沖洗系統(tǒng)至少30min，流速為1ml/min，待基線平穩(wěn)即可進行下一步操作。注意：注意：觀察柱壓是否穩(wěn)定，若不穩(wěn)定出現(xiàn)大幅度柱壓下降現(xiàn)象，很有可能是系統(tǒng)發(fā)生漏液，優(yōu)先排查色譜柱的連接處是否漏液，其次是排氣閥處，最后是觀察其他管道連接處；若流動相中含有離子，80%

5、甲醇沖洗系統(tǒng)之后，使用10%甲醇繼續(xù)沖洗系統(tǒng)至少30min。否則，會有離子析出，堵塞管路。柱壓應小于10bar，如若過大，應更換溶劑出口過濾白頭啟動液相色譜儀器的流程啟動液相色譜儀器的流程 l流動相沖洗系統(tǒng)流動相沖洗系統(tǒng)流動相配制后，先使用過濾裝置過濾，然后超聲15min，排除氣泡干擾。流速1ml/min，使用流動相沖洗系統(tǒng)至少30min，待基線平穩(wěn)即可進行下一步操作。l進樣測定進樣測定具體操作如下：點擊“序列”-“序列表”-輸入相關(guān)信息確定（樣品瓶、樣品名稱、方法名稱-TEST、進樣次數(shù)、進樣量）-“開始序列”。待進樣結(jié)束后，進行下一步操作。注意：注意：在進樣前，最好用100%甲醇進行洗針，

6、以防進樣針中殘留的其它樣品影響實驗結(jié)果。水相走A、D泵，有機相走B、C泵，可防止緩沖鹽析出啟動液相色譜儀器的流啟動液相色譜儀器的流程程 l80%80%甲醇沖洗系統(tǒng)甲醇沖洗系統(tǒng)使用80%的甲醇溶液沖洗系統(tǒng)至少30min，流速為1ml/min，待基線平穩(wěn)，將流速降為0，即可進行下一步操作。注意：若流動相中含有離子，先使用10%甲醇沖洗系統(tǒng)至少30min，后使用80%甲醇沖洗系統(tǒng)。l關(guān)閉系統(tǒng)關(guān)閉系統(tǒng)點擊工作站右下角“關(guān)閉”按鈕，待儀器顯示未就緒，關(guān)閉1260（聯(lián)機），關(guān)閉電腦，關(guān)閉液相各模塊電源。拔掉總電源即結(jié)束。流動相的選擇流動相的選擇n甲醇甲醇n質(zhì)子化溶劑 氫鍵供給者 n洗脫能力較乙腈弱n粘度較

7、乙腈高n低紫外波長下有吸收n乙腈乙腈n非質(zhì)子化溶劑 氫鍵接受者 n洗脫能力較甲醇強n粘度較甲醇低n低紫外波長下透光性好常用溶劑的極性及截止波長常用溶劑的極性及截止波長反相液相色譜，若希望出峰時間早，可以增加流動相中有機相的比例；若希望出峰時間晚，可以增加流動相中水相比例（有機相一般不低于5%）。甲醇的極限波長為210 nm ，因此，檢測波長較小時，應該選用乙腈而非甲醇；樣品稀釋最好選用流動相，可以避免溶劑峰的干擾。溶劑溶劑 水水甲醇甲醇乙醇乙醇異丙醇異丙醇乙腈乙腈四氫呋喃四氫呋喃極性常數(shù)極性常數(shù)1.000.950.880.820.650.57截止波長截止波長170210210210190210

8、流動相的選擇流動相的選擇80%甲醇沖系統(tǒng)基線不平為了得到較好的分離效果，可以在流動相中加入一些少量的有機溶劑，如三乙胺來調(diào)節(jié)峰形變“瘦”，減少拖尾現(xiàn)象。加入緩沖鹽，調(diào)節(jié)流動相的pH值或離子強度，以改變組分的保留時間達到分離效果等。一般情況下，大家如要建立色譜條件，應先去查詢中國藥典及文獻資料，再進行適當?shù)男薷?。流動相的調(diào)節(jié)流動相的調(diào)節(jié) 過濾：過濾：0.45um0.45um或更小孔徑濾膜或更小孔徑濾膜目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機鹽配制目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機鹽配制的緩沖液。的緩沖液。注意：不同的試劑分別過濾，過濾后再混合；濾膜的選擇

9、，不要混用；要現(xiàn)用現(xiàn)處理，尤其是水和緩沖液脫氣：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡脫氣：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡 氣泡對測定的影響：氣泡對測定的影響：泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積柱中氣泡使流動相繞流，峰變形柱中氣泡使流動相繞流，峰變形檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動 流動相的處理流動相的處理流動相的保存流動相的保存l有機溶劑流動相： 室溫下密封，避光保存l緩沖鹽流動相： 當日現(xiàn)配現(xiàn)用： 低溫下密封保存，一般不超過3天 防止微生物生長l有機溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動相： 低溫密封保存 防止有機相的揮發(fā)梯度洗脫

10、梯度洗脫梯度洗脫是指在一個分析周期中，按一定的程序連續(xù)改變流動相中溶劑的組成（如溶劑的極性、離子強度、pH值等）和配比，使樣品中的各個組分都能在適宜的條件下得到分離。是分析復雜混合物特別是分離保留性能相差較大的混合物的極為重要的手段。優(yōu)點：改善峰形，提高柱效 縮短分析時間 強保留成分不易殘留在柱上缺點：會引起基線漂移 有時重現(xiàn)性差 故需嚴格控制梯度洗脫的實驗條件。能等度洗脫絕不能等度洗脫絕不選擇梯度洗脫選擇梯度洗脫維護流程圖維護流程圖吸濾頭單向閥柱塞密封圈線路過濾器進樣器檢測器檢查溶劑過濾器檢查溶劑過濾器查看過濾器是否變色查看過濾器是否變色臨時取下過濾器，檢查柱前壓力是否正常臨時取下過濾器，檢

11、查柱前壓力是否正常清潔溶劑過濾器清潔溶劑過濾器將堵塞的溶劑過濾器從瓶頭組件中拿下。先用水沖洗殘留之溶劑然后將過濾器放在裝有濃硝酸濃硝酸 （3535）的燒杯里浸一小時，不要使用超聲波清洗用二次蒸餾水徹底沖洗過濾器，將過濾器重新裝好。建議定期清洗溶劑過濾器及溶劑瓶，每三個月至少清洗一次。日常維護日常維護日常維護日常維護嚴重污染的溶劑出口過濾芯嚴重污染的溶劑出口過濾芯日常維護日常維護溶劑出口過濾白頭溶劑出口過濾白頭日常維護日常維護泵的保養(yǎng)：泵的保養(yǎng)：使用流動相盡量要清潔；進液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗；流動相交換時要防止沉淀； 避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡；每次分析結(jié)束后，要反復沖洗進樣口，防止樣品的交叉污染

12、；燈的保養(yǎng)：燈的保養(yǎng)：在分析前、柱平衡得差不多時，打開檢測器；在分析完成后，馬上關(guān)閉檢測器柱的保養(yǎng)：柱的保養(yǎng)：柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動；柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動；使用預柱，保護柱堵了，異丙醇超聲清洗保護柱柱芯即可；當柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時，閥件或管路一定要清洗干凈；當柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時，閥件或管路一定要清洗干凈；要注意流動相的脫氣；要注意流動相的脫氣；避免使用高粘度的溶劑作為流動相；避免使用高粘度的溶劑作為流動相；進樣樣品要提純；進樣樣品要提純；嚴格控制進樣量；嚴格控制進樣量；每天分析工作結(jié)束后，要清洗進樣閥中殘留的樣品；每天分析工作結(jié)束后，要清洗進樣閥中殘留的樣品

13、；每天分析測定結(jié)束后，都要用適當?shù)娜軇﹣砬逑粗?；每天分析測定結(jié)束后，都要用適當?shù)娜軇﹣砬逑粗?；若分析柱長期不使用，應用適當有機溶劑保存并封閉；若分析柱長期不使用，應用適當有機溶劑保存并封閉；（用20%甲醇溶液清洗10個柱體積，保存在90%的甲醇溶液中）日常維護日常維護HPLCHPLC分析方法的建立及驗證分析方法的建立及驗證目的目的：證明采用的方法適合于相應檢測的要求。方法驗證是實驗室針對特定方法的研究過程，通過設計方案，有步驟、系統(tǒng)地收集、處理實驗數(shù)據(jù)，最終形成文件，以證明所用試驗方法準確、靈敏、專屬并重現(xiàn)。同一分析方法用于不同的檢測項目會有不同的驗證要求。驗證內(nèi)容：專屬性、線性范圍、靈敏度（

14、檢測限、定量限）、準確度、精密度（重復性、中間精密度、重現(xiàn)性）、耐用性分析方法的建立及驗證分析方法的建立及驗證專屬性專屬性系指在其他成分（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）可能存在下，采用的方法能正確測定出被測物的特性。線性線性系指在設計的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與試樣中被測物濃度直接呈正比關(guān)系的程度(一般對照品稀釋成7個濃度，每個濃度進樣3次，計算其線性方程和相關(guān)系數(shù)，其值不應低于0.99）。范圍范圍系指能達到一定精密度、準確度和線性，測試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間（區(qū)間（原料藥和制劑含量測定，范圍應為測試濃度的80%120%）。 分析方法的建立及驗證分析方法的建立及驗證靈敏度是信號與噪音的比值；即峰高

15、與基線噪音的比值靈敏度是信號與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/NS/N）檢測限（檢測限（LODLOD）：）：S/N = 24S/N = 24定量限（定量限（LOQLOQ）：）：S/N = 810S/N = 810好的信噪比有利于：好的信噪比有利于：更好的色譜峰確認更好的色譜峰確認更好的定量更好的定量更好地完成色譜峰純度更好地完成色譜峰純度/ /均一性均一性6:1NS分析方法的建立及驗證分析方法的建立及驗證準確度準確度：用該方法測定的結(jié)果與真實值或參考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。1、原料藥含量測定：回收率（%）=測得量/加入量100%-空白基質(zhì)中加入藥品2、制劑的含量測定：標準

16、加樣回收-已知濃度樣品中加入藥品 數(shù)據(jù)要求： 在規(guī)定范圍內(nèi)，至少用9個測定結(jié)果進行評價。例如，設計3個不同濃度，每個濃度各分別制備3份供試品溶液，進行測定。分析方法的建立及驗證分析方法的建立及驗證絕對回收率=提取回收率/（1基質(zhì)效應），HPLC中基質(zhì)效應為01.絕對回收率絕對回收率=提取回收率提取回收率=萃取回收率萃取回收率，是用藥品加血漿經(jīng)萃取處理后的進樣峰面積除以該藥品溶液直接進樣峰面積的比值，一般來說，該比值不可能超過100%，能做到80%就不錯了。以前國家對絕對提取率還有些要求，現(xiàn)在隨著lc-ms的應用，最低定量限已經(jīng)能做到很低，也就不需要再對絕對回收率提具體要求，只要相對回收率滿意就

17、可以。-生物樣品：用于篩選提取溶劑，可以低但要穩(wěn)定2.相對回收率相對回收率=方法學回收率方法學回收率，是血漿處理后的進樣峰面積代入血漿標準曲線，計算所得濃度除以真實血樣濃度.該比值在100%左右.一般要求高、中濃度點在15%以內(nèi)，低濃度點可適當放寬。-內(nèi)標的相對回收率值與絕對回收率要求類似(1)舉例：10ngA藥加入1ml空白血漿（10ng/ml），經(jīng)萃取處理后用0.5ml流動相復溶，進樣所得峰面積8000;配制對照溶液（濃度10ng/0.5ml=20ng/ml），進樣所得峰面積假設為10000.那么萃取回收率為8000/10000=80%.(2)舉例：上述經(jīng)萃取處理的血漿溶液（10ng/ml

18、）峰面積8000，代入標準曲線計算，假如計算所得濃度為8.5ng/ml,相對回收率則為8.5/10=85%.分析方法的建立及驗證分析方法的建立及驗證精密度精密度：在規(guī)定的測試條件下，同一個均勻供試品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度，一般用SD、RSD表示。1、重復性：在較短的時間間隔內(nèi)，在相同的操作條件下，由同一分析人員連續(xù)測定所得結(jié)果的精密度，也就是日內(nèi)（批內(nèi)）精密度（日內(nèi)（批內(nèi)）精密度（RSDRSD限度：生物制品限度：生物制品5 5，藥品藥品2 2）2、中間精密度：同一實驗室不同時間不同分析人員用不同設備測定所得結(jié)果之間的精密度。其中，由同一分析人員用同一設備在不同時間測定所得結(jié)果通

19、常稱為日間（批間）精密度日間（批間）精密度(RSD(RSD限度限度: :生物制品生物制品1515，藥品，藥品5 5) )3、重現(xiàn)性：不同實驗室不同分析人員測定結(jié)果之間的精密度（基本不做基本不做）制備3個不同濃度的樣品，每個濃度各3份 （對照品）100%水平的供試品溶液，至少測定6次的結(jié)果進行評價分析方法的建立及驗證分析方法的建立及驗證耐用性耐用性系指在測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，為使方法可用于常規(guī)檢驗提供依據(jù)。典型的變動因素有：被測溶液的穩(wěn)定性、樣品的提取次數(shù)、時間等；液相色譜法中典型的變動因素有：流動相的組成和pH 值、不同廠牌或不同批號的同類型色譜柱、柱溫、流速等。穩(wěn)

20、定性考察穩(wěn)定性考察：取同一份供試品溶液，分別于不同時間進樣測定（如0、2、4、6、8、10、12、24h）。注意：注意：大多文獻中所提及的重復性考察并不在驗證范圍內(nèi)，但較為常用重復性考察重復性考察：取同一批號供試品, 按供試品溶液制備方法制備 6 份供試液，進行含量測定。分析方法的建立及驗證分析方法的建立及驗證HPLCHPLC故障診斷故障診斷HPLC靈敏度不夠：靈敏度不夠：1樣品量不足，增加樣品量2樣品未從柱子流出，可根據(jù)樣品理化性質(zhì)改變流動相或柱子3樣品與檢測器不匹配，可根據(jù)樣品理化性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器4檢測池中有氣泡，排氣5流動相流量不合適，調(diào)整流速即可在一定范圍內(nèi)，柱溫越高或流速越大

21、，峰高越大，峰寬越小，峰面積不變，在一定范圍內(nèi)，柱溫越高或流速越大，峰高越大，峰寬越小，峰面積不變，保留時間變?。ú贿m于熱不穩(wěn)定樣品）。保留時間變小（不適于熱不穩(wěn)定樣品）。 常用柱溫：常用柱溫：25、30 常用流速：常用流速：1 ml/minHPLCHPLC故障診斷故障診斷系統(tǒng)壓力過高。系統(tǒng)壓力過高。1首先擰開排液閥，以純水作流動相并設流速為5ml/min若壓力超過10bar，應先更換排液閥的慮芯。2若排液閥的慮芯沒有堵塞，卸下色譜柱，然后用一兩通代替色譜柱，以水作流動相設流速為1ml/min。通常壓力不會超過20bar,否則系統(tǒng)可能有堵塞。3若上述的壓力超過20bar,我們可按照從后到前的原

22、則，也就是說先卸下進流動池的連接管接頭，開泵后，若壓力正常則流動池堵塞若仍不正?？蓪⑦@段管另一端也卸下，開泵后再觀察壓力情況。同樣道理，我們就可以找到堵塞的地方。容易堵塞的地方：流動池入口管；自動進樣器的針及針座；柱溫箱容易堵塞的地方：流動池入口管；自動進樣器的針及針座；柱溫箱HPLCHPLC故障診斷故障診斷系統(tǒng)壓力過低，不穩(wěn)定或沒液流。系統(tǒng)壓力過低，不穩(wěn)定或沒液流。首先擰開排液閥，設流速首先擰開排液閥，設流速12ml/min后開泵，觀察有無液流，若后開泵，觀察有無液流，若有再仔細觀察液流是否有倒吸現(xiàn)象如不能確定可用量筒測量流有再仔細觀察液流是否有倒吸現(xiàn)象如不能確定可用量筒測量流速的準確性。速

23、的準確性。如上述無液流，或流速不準多數(shù)為主動閥閥芯或主動閥故障，如上述無液流，或流速不準多數(shù)為主動閥閥芯或主動閥故障， 或泵有嚴重漏液?；虮糜袊乐芈┮?。怎樣是大致判斷主動閥抑或其閥芯故障？可用以下方法：當泵怎樣是大致判斷主動閥抑或其閥芯故障？可用以下方法：當泵運轉(zhuǎn)時用手指輕捏主動主體，正常的主動閥能感到有節(jié)奏的脈運轉(zhuǎn)時用手指輕捏主動主體，正常的主動閥能感到有節(jié)奏的脈動，如果沒有，動，如果沒有， 主動閥有問題。如果有則可以將主動閥閥芯取主動閥有問題。如果有則可以將主動閥閥芯取出進行超聲波清洗，如仍有問題，可更換閥芯。出進行超聲波清洗，如仍有問題，可更換閥芯。注意，千萬不注意，千萬不要把整個主動閥

24、放入超聲波清洗這樣會損壞主動閥。要把整個主動閥放入超聲波清洗這樣會損壞主動閥。若上述流速準確但擰緊排液閥后壓力不穩(wěn)定，請仔細檢查有無若上述流速準確但擰緊排液閥后壓力不穩(wěn)定，請仔細檢查有無漏液。漏液。(通常漏液地方：各接口包括色譜柱，泵，進樣閥等通常漏液地方：各接口包括色譜柱，泵，進樣閥等)。HPLCHPLC故障診斷故障診斷保留時間不穩(wěn)定。保留時間不穩(wěn)定。 首先觀察保留時間是否有規(guī)律的變化，并同時觀察壓力是否穩(wěn)定首先觀察保留時間是否有規(guī)律的變化，并同時觀察壓力是否穩(wěn)定 若壓力穩(wěn)定而保留時間呈有規(guī)律變化，若壓力穩(wěn)定而保留時間呈有規(guī)律變化，多數(shù)是色譜柱未平衡好，多數(shù)是色譜柱未平衡好，特別是含有鹽的流

25、動相，需較長的時間去平衡。特別是含有鹽的流動相，需較長的時間去平衡。 若壓力穩(wěn)定而保留時間無規(guī)律變化，若壓力穩(wěn)定而保留時間無規(guī)律變化，請檢查溶劑過濾頭及真空腔請檢查溶劑過濾頭及真空腔是否有堵塞。再平衡色譜柱足夠時間，如仍然不佳，可更換一色是否有堵塞。再平衡色譜柱足夠時間，如仍然不佳，可更換一色譜柱。譜柱。 若壓力不穩(wěn)定，若壓力不穩(wěn)定，請檢查造成壓力不穩(wěn)定的因素，如：漏液，排液請檢查造成壓力不穩(wěn)定的因素，如：漏液，排液時間不足夠，鹽濃度過高導致鹽析，主動閥比例閥內(nèi)漏，等。時間不足夠，鹽濃度過高導致鹽析，主動閥比例閥內(nèi)漏，等。HPLCHPLC故障診斷故障診斷峰面積重現(xiàn)性不好。峰面積重現(xiàn)性不好。 首

26、先觀察壓力是否穩(wěn)定，以及觀察峰面積變化是否有規(guī)律。首先觀察壓力是否穩(wěn)定，以及觀察峰面積變化是否有規(guī)律。 若壓力不穩(wěn)定，若壓力不穩(wěn)定，請檢查造成壓力不穩(wěn)定的因素，如：漏液，排液時請檢查造成壓力不穩(wěn)定的因素，如：漏液，排液時間不足夠，鹽濃度過高導致鹽析，主動閥比例閥內(nèi)漏，等。間不足夠，鹽濃度過高導致鹽析，主動閥比例閥內(nèi)漏，等。 若壓力穩(wěn)定但峰面積呈無規(guī)律變化，若壓力穩(wěn)定但峰面積呈無規(guī)律變化，請檢查樣品是否足夠，確認樣請檢查樣品是否足夠，確認樣品的穩(wěn)定性，必要時重新配制。檢查進樣閥是否漏液。等。品的穩(wěn)定性，必要時重新配制。檢查進樣閥是否漏液。等。 若壓力穩(wěn)定且若壓力穩(wěn)定且峰面積呈規(guī)律變化，峰面積呈規(guī)律變化，多數(shù)為色譜柱未平衡好。多數(shù)為色譜柱未平衡好。雙峰：進樣量過大？預柱有氣泡？-純甲醇超聲拖尾峰：流動相中添加三乙胺等減尾劑峰展寬：流動相粘度過高？：流動相粘度過高？-提高柱溫提高柱溫峰前延：柱溫低HPLCHPLC故障診斷故障診斷基線不穩(wěn)定?；€不