DNA重組及重組DNA技術(shù)解讀

1、第二十一章第二十一章 DNA 重組和重組重組和重組DNA 技術(shù)技術(shù) DNA Recombination and Recombinant DNA technology 77 1 目錄目錄 廣義上， 任何造成基因型變化的基因交流過(guò)程 ?DNA重組重組（DNA recombination）是指不）是指不同同DNA分子斷裂和連接而產(chǎn)生分子斷裂和連接而產(chǎn)生 DNA片段片段的交換并重新組合形成新的交換并重新組合形成新DNA 分子的過(guò)程。分子的過(guò)程。 ?重重 組組 DNA 技技 術(shù)術(shù) （ recombinant DNA technology ）是指在體外將兩個(gè)或兩個(gè)以）是指在體外將兩個(gè)或兩個(gè)以上上DNA 分

2、子重新組合并在適當(dāng)細(xì)胞中增殖分子重新組合并在適當(dāng)細(xì)胞中增殖形成新形成新DNA 分子的過(guò)程。分子的過(guò)程。 77 目錄目錄 2 DNA重組的意義 ?發(fā)生在生物體內(nèi)基因的交換或重新組合是生物遺傳變異遺傳變異的一種機(jī)制。 ?在進(jìn)化、繁殖、病毒感染、基因表達(dá)以及致癌基因激活等過(guò)程中，基因重組都起重要作用。 ?基因重組也歸類(lèi)為自然突變自然突變現(xiàn)象。 77 目錄目錄3 第一節(jié)第一節(jié) 自然界自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移重組和基因轉(zhuǎn)移是經(jīng)常發(fā)生的是經(jīng)常發(fā)生的 DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature 77 4 目錄目錄 DNA重組

3、重組 同源重組同源重組 (homologous recombination) 接合作用接合作用 (conjugation) 轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化作用 (transformation) 轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 (transduction) 位點(diǎn)特異的重組位點(diǎn)特異的重組(site-specific recombination) 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 座座 (transposition) 異常重組異常重組 77 目錄目錄5 一、同源重組是最基本的一、同源重組是最基本的DNA重組方式重組方式 ? 發(fā)生在同源序列間的重組稱(chēng)為發(fā)生在同源序列間的重組稱(chēng)為同源重組同源重組(homologous recombination) ，又稱(chēng)又稱(chēng)基本

4、重基本重組（組（general recombination）。是最基本的。是最基本的DNA重組方式，通過(guò)鏈的斷裂和再連接，重組方式，通過(guò)鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)在兩個(gè) DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。鏈片段的交換。 ? 以以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機(jī)的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制的制的Holliday 模型。模型。 77 目錄目錄6 Holliday模型的模型的4個(gè)關(guān)鍵步驟：個(gè)關(guān)鍵步驟： ? 兩個(gè)同源染色體兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊；排列整齊； ? 一個(gè)一個(gè)DNA的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)的一條鏈斷裂、并與另一個(gè) DNA對(duì)應(yīng)的鏈連接，形

5、成對(duì)應(yīng)的鏈連接，形成 Holliday 中間體；中間體； ? 通過(guò)分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈通過(guò)分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈 DNA； ?Holliday 中間體切開(kāi)并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈中間體切開(kāi)并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體重組體DNA，分別為：，分別為： 片段重組體片段重組體(patch recombinant) 拼接重組體拼接重組體(splice recombinant) 77 目錄目錄7 ? 片段重組體片段重組體 （見(jiàn)模型圖左邊產(chǎn)物）：（見(jiàn)模型圖左邊產(chǎn)物）： 切開(kāi)的鏈與原來(lái)斷裂的是同一條鏈，重組切開(kāi)的鏈與原來(lái)斷裂的是同一條鏈，重組 體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來(lái)自同一親體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來(lái)自同

6、一親本本DNA。 ? 拼接重組體拼接重組體（見(jiàn)模型圖右邊產(chǎn)物）：（見(jiàn)模型圖右邊產(chǎn)物）： 切開(kāi)的鏈并非原來(lái)斷裂的鏈，重組體異源雙切開(kāi)的鏈并非原來(lái)斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來(lái)自不同親本鏈區(qū)的兩側(cè)來(lái)自不同親本 DNA。 77 目錄目錄8 5 3 3 3 5 內(nèi)切酶內(nèi)切酶 5 3 5 3 3 (recBCD) 5 3 5 5 3 5 3 5 5 3 3 5 3 5 5 內(nèi)切酶內(nèi)切酶 3 (recBCD) 5 3 3 5 3 5 3 3 DNA 連接酶連接酶 77 DNA 侵?jǐn)_侵?jǐn)_ (recA) 5 3 3 5 3 5 5 3 5 3 3 5 3 5 5 3 Holiday 中間體中間體 9 分支

7、遷移分支遷移 (recA) 53 35 35 53 Holiday 中間體中間體 35 內(nèi)切酶內(nèi)切酶 (ruvC) 5 3 3 5 35 353 DNA 5 連接酶連接酶 3 5 3 5 片片段段重重5 53 組組體體3 3 5 3 內(nèi)切酶內(nèi)切酶 5 (ruvC) 3 5 3 5 55 3 3 DNA 拼拼連接酶連接酶 3 5 接接5 重重3 組組35 77 體體5 3 10 DNA重組重組 同源重組同源重組 (homologous recombination) 接合作用接合作用 (conjugation) 轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化作用 (transformation) 轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 (transdu

8、ction) 位點(diǎn)特異的重組位點(diǎn)特異的重組(site-specific recombination) 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 座座 (transposition) 77 目錄目錄11 第二節(jié)第二節(jié) 重組重組DNA技術(shù)技術(shù) 又稱(chēng)又稱(chēng)DNA克隆或分子克隆克隆或分子克隆 DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone 77 12 目錄目錄 重組重組DNA 技術(shù)的發(fā)展史技術(shù)的發(fā)展史 1865年年 G.J.Mendel 的豌豆雜交試驗(yàn)。的豌豆雜交試驗(yàn)。 1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

9、。 1973年年 美國(guó)斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建美國(guó)斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組第一個(gè)重組DNA 分子分子。 1977年年 美國(guó)南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳美國(guó)南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專(zhuān)門(mén)應(yīng)用重組工程公司，專(zhuān)門(mén)應(yīng)用重組DNA 技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物藥物。 1980年年 開(kāi)始建造第一家應(yīng)用重組開(kāi)始建造第一家應(yīng)用重組DNA 技術(shù)生產(chǎn)技術(shù)生產(chǎn)胰島素胰島素的工廠。的工廠。 1997年年 英國(guó)羅林研究所成功的英國(guó)羅林研究所成功的克隆了多莉克隆了多莉。 77 13 目錄目錄 77 目錄目錄14 本節(jié)主要內(nèi)容：本節(jié)主要內(nèi)容： ?相關(guān)概念相關(guān)概念

10、 ? DNA 克隆克隆 ? 工具酶工具酶 ? 目的基因目的基因 ? 基因載體基因載體 ?基本原理基本原理 ?重組重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系 77 目錄目錄15 ?一、重組一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念技術(shù)相關(guān)概念 克隆克隆 (clone):來(lái)自同一始祖的相同副本或拷來(lái)自同一始祖的相同副本或拷 (cloning) ， 77 目錄目錄16 （一）（一） DNA克隆克隆貝的集合。貝的集合。獲取同一拷貝的過(guò)程稱(chēng)為克隆化獲取同一拷貝的過(guò)程稱(chēng)為克隆化即無(wú)性繁殖。即無(wú)性繁殖。技術(shù)水平：技術(shù)水平： (molecular clone) DNA 克?。┛寺。?細(xì)胞克隆細(xì)胞克隆 個(gè)體克隆（動(dòng)物或植物）個(gè)

11、體克?。▌?dòng)物或植物） 77 目錄目錄17 ?分子克隆分子克?。矗??DNA克隆克隆 應(yīng)用酶學(xué)的方法，在應(yīng)用酶學(xué)的方法，在 體外體外將各種來(lái)源的遺將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的天然的或人工的 DNA）與載體）與載體DNA接合成一接合成一具具有有 自自 我我 復(fù)復(fù) 制制 能能 力力 的的 DNA分分 子子 復(fù)復(fù) 制制 子子(replicon) ，繼而通過(guò)，繼而通過(guò) 轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染 宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞， 篩篩選選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取提取獲得大量同一獲得大

12、量同一 DNA分子，也稱(chēng)分子，也稱(chēng) 基因克隆或基因克隆或重組重組DNA (recombinant DNA) 。 77 目錄目錄18 ? 生物技術(shù)工程生物技術(shù)工程: 基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等工程、細(xì)胞工程等 ? 基因工程基因工程(genetic engineering) 實(shí)現(xiàn)基因?qū)崿F(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱(chēng)基因工程，克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱(chēng)基因工程，又稱(chēng)重組又稱(chēng)重組DNA工藝學(xué)。工藝學(xué)。 ? 目的：目的： 分離獲得某一感興趣的基因或分離獲得某一感興趣的基因或 DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)） 77 目

13、錄目錄19 （二）工具酶（二）工具酶 ? 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶? DNA 聚合酶聚合酶 ? 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 ? T4DNA連接酶連接酶 ? 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 ? 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶 ? Taq DNA 聚合酶聚合酶 77 目錄目錄20 重組重組DNA技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中常用的工具酶 工工 具具 酶酶 功功 能能 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 識(shí)別特異序列，切割識(shí)別特異序列，切割DNA DNA連接酶連接酶 催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5磷酸基和磷酸基和3羥基末端之間形成磷酸羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段

14、連接分子或片段連接 DNA聚合酶聚合酶 合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接分子或片段連接 缺口平移制作高比活探針缺口平移制作高比活探針 DNA序列分析序列分析 填補(bǔ)填補(bǔ)3末端末端 Klenow片段片段 又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的5?3? ?聚合、聚合、3?5? ?外切活性，而無(wú)外切活性，而無(wú)5?3? ?外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈第二鏈合成，雙鏈DNA 3? ?末端標(biāo)記等末端標(biāo)記等 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 合成合成cDNA 替代替代DNA聚合酶聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析序列分析 多聚

15、核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶 在在3羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 切除末端磷酸基切除末端磷酸基 77 21 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease) ? 定義：定義： 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 (restriction endonuclease, RE)是識(shí)別是識(shí)別DNA的特異序列的特異序列, 并在識(shí)別位點(diǎn)或其并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈周?chē)懈铍p鏈DNA的一類(lèi)內(nèi)切酶。的一類(lèi)內(nèi)切酶。 Bam H

16、GGATCC CCTAGG G GATCC + CCTAG G 77 目錄目錄 22 ? 分類(lèi)：酶的組成、所需因子及裂解分類(lèi)：酶的組成、所需因子及裂解 DNA的方的方式式 、（基因工程技術(shù)中常用（基因工程技術(shù)中常用 型）型） ? 作用：作用： 與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身，保護(hù)自身DNA。 77 目錄目錄23 ? 命名：命名： Hin d Haemophilus influenzae d株株 流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶 屬屬 系系 株株 序序 第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫(xiě)；第一個(gè)

17、字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫(xiě)； 第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫(xiě)；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫(xiě)； 第四個(gè)字母代表株；第四個(gè)字母代表株； 用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。 77 目錄目錄24 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)(palindrome) GGCCTAATGG CC 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口 77 目錄目錄25 類(lèi)酶識(shí)別序列特點(diǎn)類(lèi)酶識(shí)別序列特點(diǎn)Hind GTCGAC CAGCTG GTC CAG + GAC CTG 平端切口平端切口 Bam H GGATCC CCTAGG G CCTAG + GATCC G 粘端切口粘端切口 77

18、 目錄目錄26 （三）目的基因（三）目的基因(target gene) ?cDNA (complementary DNA) 指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與 RNA ( 通常指通常指mRNA 或病毒或病毒RNA)互補(bǔ)的單鏈互補(bǔ)的單鏈DNA。以。以單鏈單鏈cDNA 為模板、經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙為模板、經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈鏈cDNA 。 ? 基因組基因組DNA (genomic DNA) 指代表一個(gè)細(xì)胞或生物體整套遺傳信息指代表一個(gè)細(xì)胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體染色體及線粒體)的所有的所有DNA序列。序列。 77 目錄目錄27 （四）基因載體（四）基因載體 ? 定義定義 為攜帶目的

19、基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些一些DNA分子。分子。 ? 常用載體常用載體 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA 噬菌體噬菌體DNA 病毒病毒DNA 77 目錄目錄28 ?克隆載體克隆載體(cloning vector) 為使插入的外源為使插入的外源 DNA序列被擴(kuò)增而特意序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱(chēng)為設(shè)計(jì)的載體稱(chēng)為克隆載體克隆載體。 ?表達(dá)載體表達(dá)載體(expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成 多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱(chēng)為多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱(chēng)為 表達(dá)載體表達(dá)載體。 77

20、 目錄目錄29 1.1.質(zhì)粒質(zhì)粒 (plasmid) 特點(diǎn)特點(diǎn): : 能在宿主細(xì)胞內(nèi)能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺；帶有某些遺傳信息傳信息, , 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。 77 目錄目錄 30 77 31 2.2.噬菌體噬菌體(phage) ? 噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用系列（插入型，適用 cDNA克?。┛寺。?EMBL系列（置換型，適用基因組克隆）系列（置換型，適用基因組克隆） ? M13 噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含改造系統(tǒng)（含lacZ 基因）基因） M13mp 系列系列 pUC 系列系列 77 目錄目錄

21、 32 4.其他其他 ? 酵母人工染色體酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC) ? 細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) ? 動(dòng)物病毒動(dòng)物病毒DNA改造的載體改造的載體 桿狀病毒）桿狀病毒）（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒， 77 目錄目錄33 二、重組二、重組DNA技術(shù)基本原理技術(shù)基本原理 ? 基本原理基本原理 目的基因的獲取目的基因的獲取 克隆載體的選擇和構(gòu)建克隆載體的選擇和構(gòu)建 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞 外源基因與載體的連

22、接外源基因與載體的連接 重組體的篩選重組體的篩選 克隆基因的表達(dá)克隆基因的表達(dá) 77 目錄目錄 34 重組重組DNADNA技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為：技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為： 分分 切切 接接 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 篩篩 分離目的基因分離目的基因 限制酶切目的基因與載體限制酶切目的基因與載體 拼接重組體拼接重組體 轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 篩選重組體篩選重組體 77 目錄目錄35 （一）目的基因的獲?。ㄒ唬┠康幕虻墨@取 1.化學(xué)合成法化學(xué)合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列物的氨基酸序列 。 2.基因組基因組DNA文庫(kù)文庫(kù)(genomic DNA l

23、ibrary) 3. cDNA文庫(kù)文庫(kù)(cDNA library) 4.聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR) ( 見(jiàn)第見(jiàn)第22 章章) 77 目錄目錄36 化學(xué)合成法獲取目的基因化學(xué)合成法獲取目的基因 由已知氨基酸序列推測(cè)可能的由已知氨基酸序列推測(cè)可能的 DNA序列。序列。 77 目錄目錄37 ?從基因組從基因組DNA文文庫(kù)獲取目的基因庫(kù)獲取目的基因 基因組基因組DNA文庫(kù)文庫(kù) 存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所由克隆載體所攜帶的所有基因組有基因組DNA的集合的集合 組織或細(xì)胞染色體組織或細(xì)胞染色體 DNA 限制性內(nèi)切酶限制

24、性內(nèi)切酶 基因片斷基因片斷 克隆載體克隆載體 重組重組DNA分子分子 受體菌受體菌 含重組分子的轉(zhuǎn)化菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌 77 38 限制酶切位點(diǎn)限制酶切位點(diǎn) cos L R cos 真核生物染真核生物染 色體色體DNA 限制酶消化限制酶消化 cos L 左臂左臂 限制酶部分消化限制酶部分消化 除去中間片段除去中間片段 R cos 右臂右臂 20 Kb DNA 片段片段 外源外源DNA 與載體與載體DNA混合混合 cos L 20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 R cos 連接反應(yīng)連接反應(yīng) 體外包裝體外包裝 用重組噬菌體用重組噬菌體 感染大腸桿菌感染大腸桿菌 基因文庫(kù)基因文庫(kù) 用隨機(jī)切割的

25、真核生物染色體用隨機(jī)切割的真核生物染色體77 DNA片段構(gòu)建基因文庫(kù)片段構(gòu)建基因文庫(kù) 39 ? 從從cDNA文庫(kù)獲取目的基因文庫(kù)獲取目的基因 mRNA 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 cDNA 復(fù)制復(fù)制 雙鏈雙鏈cDNA 載體載體 重組重組DNA分子分子 受體菌受體菌 cDNA文庫(kù)文庫(kù) AAAA 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 A A A A T T T T 堿水解堿水解 T T T T DNA聚合酶聚合酶 SISI核酸酶核酸酶 77 40 （二）克隆載體的選擇和構(gòu)建（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建 目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方法也不同。載體的選擇和改建方法也不同。 77 目錄

26、目錄41 （三）外源基因與載體的連接（三）外源基因與載體的連接 1.粘性末端連接粘性末端連接 77 目錄目錄42 同同一一限限制制酶酶切切位位點(diǎn)點(diǎn)連連接接 GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用目的基因用 Bam H切割切割 GCCTAGGCCTAGBam H切割反應(yīng)切割反應(yīng) GATCC G 載體載體DNA 用用Bam H切割切割 + GATCCGGATCCGGGATCCCCTAG GGGATCCCCTAG GGGATCCCCTAG GGGATCCCCTAG GT4 DNA 連接酶連接酶 15o C 載體自連載體自連 重組體重組體 77 目的基因自連目的基因自連 43 GGAT

27、CCCCTAG GGGATCCCCTAG G不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接 Eco R切割位點(diǎn)切割位點(diǎn) Bg l切割位點(diǎn)切割位點(diǎn) GCTTAAAATTCGCTTAAGGAATTCAGATCTTCTAGAATCTAGGATCTAEcoR雙酶切雙酶切+ Bg l Eco R雙酶切雙酶切+ Bg l AATTCAATTCGATCTAGGGATCT+ AATTCGATCTAGAT4 DNA 連接酶連接酶 15o C 配伍末端的配伍末端的GCTTAAAATTCG連接情況和同一連接情況和同一ATCTAGGATCTA限制酶切位點(diǎn)連限制酶切位點(diǎn)連重組體重組體 接相似。

28、接相似。 77 44 2.平端連接平端連接 77 目錄目錄45 目的基因目的基因 載體載體 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 T4 DNA 連接酶連接酶 15o C 重組體重組體 目的基因目的基因 自連自連 46 載體自連載體自連 77 3.同聚物加尾連接同聚物加尾連接 77 目錄目錄47 目的基因目的基因 5 3 5 3 限制酶或機(jī)械剪切限制酶或機(jī)械剪切 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶 5 3 載體載體DNA 限制酶限制酶 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶 3 5 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶 + dTTP T(T)nT 3 5 5 3 A(A)nA 3 5 5 3 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)

29、移酶 + dATP A(A)nA 3 5 3 T(T)nT 5 T4 DNA 連接酶連接酶 15o C 重組體重組體 77 48 4.人工接頭人工接頭(linker)連接連接 77 目錄目錄49 人人工工接接頭頭及及其其應(yīng)應(yīng)用用 Eco R 5 - CCGAATTCG 3- GGCTTAAGC Eco R Eco R Eco R 77 50 （四）重組（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌導(dǎo)入受體菌 ?受體菌條件：受體菌條件： 安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷 處于感受態(tài)處于感受態(tài)(competent)?導(dǎo)入方式：導(dǎo)入方式： 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 (transformation) 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染

30、(transfection) 感染感染 (infection) 77 目錄目錄51 77 目錄目錄52 （五）重組體的篩選（五）重組體的篩選 抗抗 ( (藥藥插插性性入入標(biāo)標(biāo)失失記記活活選選法法擇擇) ) 77 53 互互補(bǔ)補(bǔ) 利用利用77 互補(bǔ)原理篩選重組體互補(bǔ)原理篩選重組體pUC18 54 重組重組DNA技術(shù)操作的主要步驟技術(shù)操作的主要步驟 載體載體 質(zhì)粒質(zhì)粒 噬菌體噬菌體 病毒病毒 目的基因（外源基因）目的基因（外源基因） 基因組基因組DNA cDNA 人工合成人工合成 PCR產(chǎn)物產(chǎn)物 開(kāi)環(huán)載體開(kāi)環(huán)載體DNA 限制酶消化限制酶消化 目的基因目的基因 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 體外包裝，轉(zhuǎn)染體外包裝，轉(zhuǎn)染

31、 重組體重組體 連接酶連接酶 帶重組體的宿主帶重組體的宿主 篩選篩選 表型篩選表型篩選 酶切電泳鑒定酶切電泳鑒定 77 菌落原位雜交菌落原位雜交 55 目錄目錄 （六）克隆基因的表達(dá)（六）克隆基因的表達(dá) 77 目錄目錄56 1. 原核表達(dá)體系原核表達(dá)體系 (E.coli表達(dá)體系最為常用表達(dá)體系最為常用) ? 標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志選擇標(biāo)志 強(qiáng)啟動(dòng)子強(qiáng)啟動(dòng)子 翻譯調(diào)控序列翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點(diǎn)多接頭克隆位點(diǎn) ? E.coli 表達(dá)體系的不足表達(dá)體系的不足： 不宜表達(dá)真核基因組不宜表達(dá)真核基因組 DNA； 不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)；不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)； 表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體表達(dá)

32、的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 (inclusion body) ； 很難表達(dá)大量可溶性蛋白。很難表達(dá)大量可溶性蛋白。 77 目錄目錄57 2.2.真核表達(dá)體系（酵母、昆蟲(chóng)、乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞）真核表達(dá)體系（酵母、昆蟲(chóng)、乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞） ? 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的可表達(dá)克隆的cDNA 及真核基因組及真核基因組DNA 可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì) 表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累 ? 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、不經(jīng)濟(jì)操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、不經(jīng)濟(jì) ? 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程 方法：方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染磷酸鈣轉(zhuǎn)染 DEAE 葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 電穿孔電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射顯微注射 77 目錄目錄 58 第三節(jié)第三節(jié) 重組重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)技術(shù)與醫(yī)學(xué) 的關(guān)系非常密切并前景遠(yuǎn)大的關(guān)系非常密切并前景遠(yuǎn)大 DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective 77 59 目錄目錄 一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆 根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)， ? 疾病