人白細(xì)胞介素,IL2試劑盒說明書

1、人白細(xì)胞介素 2（IL-2 ）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書第一部分 ELISA 簡介ELISA 是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定 （Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay） 的簡稱。自上世紀(jì) 70 年代初 問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍 保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，受檢標(biāo)本 （測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗 原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開

2、。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。 此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色 產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的 催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。第二部分ELISA的樣本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備在收集樣本前都必須有一個(gè)完整的計(jì)劃，必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。對收集后當(dāng)天就進(jìn)行檢測的樣本，及時(shí)儲(chǔ)存在 4 C備用。對于隔天再檢測的樣本，及時(shí)分裝后凍存在-20 C備用，有條件的，最好-70 C凍存?zhèn)溆?。?biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融。液體類標(biāo)本 : 包括血

3、清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清等。1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn)/ 分）。仔細(xì)收集上清，保存 過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn)/ 分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。3. 尿液：用無菌管收集，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn)/ 分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀 形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實(shí)行。4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時(shí)，用無菌

4、管收集。離心20分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn)/ 分）。仔細(xì)收集上清。5. 培養(yǎng)細(xì)胞：檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS （）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融或加入組織蛋白萃取試劑，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（ 2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。6. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的 PBS。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?biāo)本融化后仍 然保持2-8 C的溫度。加入一定量的 PBS（），或組織蛋白萃取試劑，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿化。 離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。

5、分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。7. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20 C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融8. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP活性。第三部分ELISA試劑盒的檢測目的和實(shí)驗(yàn)原理1. 檢測目的本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中白細(xì)胞介素2 （IL-2 ）含量。2. 實(shí)驗(yàn)原理本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人白細(xì)胞介素2（ IL-2 ）水平。用純化的人白細(xì)胞介素2（ IL-2）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入白細(xì)胞介素2（ IL-2 ），再與HRP標(biāo)記

6、的白細(xì)胞介素 2（ IL-2 ）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在 HRF酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的白細(xì)胞介素2（ IL-2 ）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（0D值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人白細(xì)胞介素2（ IL-2 ）濃度。第四部分試劑盒組成試劑盒組成48T96T保存說明書1份1份圭寸板膜2 片（ 48）2 片（96）密封袋1個(gè)1個(gè)酶標(biāo)包被板1 X 481X 962-8 C保存標(biāo)準(zhǔn)品（2400pg/ml ）X 1瓶X 1瓶2-8 C保存標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液X 1瓶X 1瓶2-8 C保存酶

7、標(biāo)試劑3ml X 1 瓶6ml X 1 瓶2-8 C保存樣品稀釋液3ml X 1 瓶6ml X 1 瓶2-8 C保存顯色劑A液3ml X 1 瓶6ml X 1 瓶2-8 C保存顯色劑B液3ml X 1 瓶6ml X 1 瓶2-8 C保存終止液3ml X 1 瓶6ml X 1 瓶2-8 C保存濃縮洗滌液（20 倍）20ml X 1瓶（30 倍）20ml X 1瓶2-8 C保存第五部分操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。1200pg/ml5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150卩I的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150卩I標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液600pg/ml4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品1501的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加

8、入1501標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液300pg/ml3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150 11的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150 11標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液150pg/ml2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150 11的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150 11標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液75pg/ml1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150 11的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150 11標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50卩I ,待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40卩I，然后再加待測樣品10卩I （樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。3. 溫育：用封板膜封板后置 37C溫育30分鐘。4. 配液：

9、將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30倍稀釋后備用5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50卩I，空白孔除外。7. 溫育：操作同3。8. 洗滌：操作同5。9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50卩I，再加入顯色劑 B50卩I，輕輕震蕩混勻，37C避光顯色 15分鐘.10. 終止：每孔加終止液 50卩I，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（ OD值）。測定應(yīng)在加終止液后 15分鐘以 內(nèi)進(jìn)行。第六部分計(jì)算12. 操作程序總結(jié)：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐

10、標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度 與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋 倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。第七部分注意事項(xiàng)1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。2 濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。3 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間最好控制在 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4 請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計(jì)算時(shí)請最后乘以總稀釋倍數(shù)（X nx