凋亡調(diào)劑因子與藥物耐受性

1、凋亡調(diào)劑因子與藥物耐受性腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性是臨床化療失敗的重要緣故。 本文綜述細(xì)胞凋亡調(diào)劑因子p53、bcl-二、bax等對腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制 的阻礙和P53蛋白等對P 一糖蛋白和多藥耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)劑作 用，并介紹部份多耐藥性新的研究進(jìn)展。放療和化療對腫瘤細(xì)胞有明顯殺傷作用。但是成功醫(yī)治的一 個重要障礙是腫瘤細(xì)胞對上述醫(yī)治無反映，并顯現(xiàn)耐受細(xì)胞群，致使 惡性腫瘤復(fù)發(fā)或浸潤進(jìn)展。因此了解細(xì)胞對化療藥物耐受基礎(chǔ)成為許 多實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)。一樣而言，研究的重點(diǎn)是說明醫(yī)治因子如何達(dá)到 細(xì)胞內(nèi)靶位點(diǎn)，并檢查藥物與靶位點(diǎn)彼此作用的分子基礎(chǔ)，如高水平 表達(dá)MDRI基因能夠限制多種藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度

2、，并引發(fā)多耐藥性 (MDR)。最近幾年里，探討和了解細(xì)胞凋亡機(jī)制，對腫瘤細(xì)胞取得或 失去耐受細(xì)胞毒性機(jī)制有了新的熟悉。1凋亡調(diào)劑因子對耐藥性的調(diào)劑作用許多藥物能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，包括抗代謝藥、脫氧核苜酸合成 抑制劑、DA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、烷化劑及干擾微管藥物等1?；?藥物引發(fā)凋亡的進(jìn)程還不十分清楚，可能是藥物打斷了正常的細(xì)胞生 長周期所致2。凋亡是一種能夠被激活或抑制的可調(diào)劑進(jìn)程，因此可 能還有在某些情形下藥物耐受性的新說明。p53野生型p53 (wt-p53)在細(xì)胞生長進(jìn)程中以“分子警察”身 份監(jiān)視細(xì)胞內(nèi)DA狀態(tài)，當(dāng)DNA受損后，p53通過轉(zhuǎn)錄后穩(wěn)固機(jī)制抑 制細(xì)胞停留在G1期，使細(xì)胞有時刻修復(fù)

3、，假設(shè)修復(fù)失敗，wt-p53將 角發(fā)細(xì)胞凋亡。wt-p53缺乏或發(fā)生突變，將失去“分子警察”作用， 不能誘導(dǎo)受損細(xì)胞凋亡，而使受損細(xì)胞得以生存。但由于細(xì)胞失G1 期細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的DA損傷監(jiān)視作用，易造成諸如缺失、擴(kuò)增和易 位等染色體畸變。Malcomson3采納溫控p53表達(dá)載體轉(zhuǎn)染鼠胚胎成纖維細(xì)胞 株，在鬼臼乙叉武(VP-16)作用下，32條件時，wt-p53表達(dá)，細(xì) 胞滯留在G1期，明顯表現(xiàn)出對藥物介導(dǎo)凋亡的耐受性；而在37時， 表達(dá)突變型P53,細(xì)胞在VP-16作用下，無明顯生長抑制，繼續(xù)增殖， 并顯示出劑量依托性的細(xì)胞凋亡增多。提示wt-p53能介導(dǎo)細(xì)胞對 VP-16的耐受性。wt-

4、P53介導(dǎo)的耐藥性可能與藥物作用特點(diǎn)有關(guān)。 VP-16為細(xì)胞周期特異性藥，要緊作用于細(xì)胞周期的S期，干擾DNA 的合成。必然劑量的VP-16作用細(xì)胞后，wt-p53使得細(xì)胞滯留在G1 期而不繼續(xù)增殖，因此，VP-16作用的靶位點(diǎn)減少，猶如TopoH酶含 量下降介導(dǎo)的耐藥性一樣，引發(fā)細(xì)胞對VP-16的耐藥性。Wosikowski 4 檢測13例對阿霉素(ADM)、長春花堿、順鐺(CDDP)、VP-16和胺苯 丫咤等耐藥的乳腺癌細(xì)胞株，僅1例發(fā)生P53基因突變。但許多學(xué)者以為低濃度化療藥物可引發(fā)表達(dá)wt-p53的細(xì)胞 凋亡，在缺乏wt-婦生基因突變后，須大劑量藥物方能引發(fā)細(xì)胞死亡 5、wt-P53

5、的缺失或突變間接致使了藥物耐受性。Lowe6通過體內(nèi) 實(shí)驗(yàn)發(fā)覺，表達(dá)Wt-p53基因的腫瘤細(xì)胞在經(jīng)Y放射性和ADM醫(yī)治后， 絕大多數(shù)細(xì)胞發(fā)生凋亡；相反，相同因子醫(yī)治p53基因缺點(diǎn)的腫瘤細(xì) 胞MEFS,對放療和幾種化療藥物有較強(qiáng)的耐藥性。但將wt-p53基因 轉(zhuǎn)染到MEFS細(xì)胞，低劑量放療，或小劑量的ADM、VP-16等藥物處置 后細(xì)胞迅速凋亡。還有報導(dǎo)wt-p53能增進(jìn)體外培育的人粘液表皮樣癌 細(xì)胞凋亡。p53對細(xì)胞耐藥性的調(diào)劑可能是雙向的，具體作用方式可能與細(xì)胞種類、狀態(tài)及藥物作用特點(diǎn)和劑量有關(guān)。如突變型P53可能更多引發(fā)細(xì)胞對細(xì)胞周期非特異性藥物耐受，而wt-p53介導(dǎo)細(xì)胞對某些 細(xì)胞周期

6、異性藥物耐受。Bcl-2家族一些研究發(fā)覺bcl-2基因家族蛋白表達(dá)水平轉(zhuǎn)變，能顯著改 變腫瘤細(xì)胞株對化療藥物誘導(dǎo)凋亡的阻抗。Dole 7用bcl-2表達(dá)載體 轉(zhuǎn)染人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Shep-1,發(fā)覺高表達(dá)bcl-2克隆的細(xì)胞 株對CDDP和VPT6引發(fā)的細(xì)胞毒性呈劑量依托性阻抗°Miyashital 采納基因轉(zhuǎn)染方式，發(fā)覺be”2能使細(xì)胞增加對地塞米松、氨甲喋吟、 阿糖胞甘、長春新堿（VCR）、VPT6和CDDP等藥物耐受性。與對照組 細(xì)胞相較，bcl-2蛋白并非阻礙藥物對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，但 在維持細(xì)胞存活中起著重要調(diào)劑作用。在VP-16和CDDP等化療藥物去 除后，be

7、”2蛋白能夠從頭啟動細(xì)胞增殖，使細(xì)胞取得耐藥性。Pantazis8研究VCR誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞株U-937/WT形成VCR耐藥細(xì)胞亞株U-937/RV,在U-937/WT細(xì)胞中不能檢出凋亡抑制蛋 白bcl-2和bcl-xl表達(dá)，而在U-9377/RV都可檢出;但在U-937/RV 中亦可檢出bax蛋白表達(dá)，后者是一種凋亡啟動因子，是一種bcl-2 蛋白的異源二聚體，可抵銷bcl-2的活性作用，而在靈敏株中未檢出 bax蛋白。由此可見bcl-2家族在細(xì)胞耐藥進(jìn)程中的作用也是彼此調(diào) 劑和彼此制約的。p53與bcl-2家庭間的彼此阻礙細(xì)胞凋亡是一個多因子參加的復(fù)雜的生理進(jìn)程，藥物阻礙能 誘發(fā)P53和b

8、cl-2等蛋白發(fā)生一系列轉(zhuǎn)變，參與細(xì)胞的耐藥性。Miyashi 9研究發(fā)覺wt-p53能與bcl-2基因上p53依托性的 負(fù)反映元件結(jié)合抑制bcl-2的表達(dá)°Eliopoulos10檢測p53和bcl-2 蛋白在靈敏和耐藥的卵巢癌細(xì)胞株中表達(dá)水平，結(jié)果顯示耐藥株過度 表達(dá)p53和bcl-2蛋白,且bcl-2作用環(huán)節(jié)可能在p53之上。許多臨 床資料亦發(fā)覺突變型P53和bcl-2蛋白的高表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)。將Wt-p53傳染W(wǎng)t-p53陰性的HL-60細(xì)胞形成轉(zhuǎn)染株SN3,與母代細(xì)胞相較，對化療藥物的靈敏性明顯增加，如對CDDP和 胸甘(thymidine)的靈敏性別離增加2倍和50倍；

9、而用突變型p53 傳染的細(xì)胞非常現(xiàn)象。用胸仃合成酶抑制劑FdUrd觀看與p53相關(guān)聯(lián) 基因表達(dá)轉(zhuǎn)變，在各類濃度的FdUrd存在下，專門大比例的SN3細(xì)胞 發(fā)生凋亡，而不是停留在S期。母代細(xì)胞有不確信的bax水平和高水 平的bcl-2表達(dá)。在SN3細(xì)胞bcb2檢測不出，并維持適當(dāng)基礎(chǔ)水平 的baxo FdUrd醫(yī)治后，wt-p53和bax水平增加，但bax誘導(dǎo)早于p53, 且平行顯現(xiàn)細(xì)胞凋亡的DNA條帶。Perego12檢測p53與順伯致使耐 藥性間的關(guān)系時，發(fā)此刻卵巢癌藥細(xì)胞株中，突變型P53失去激活bax 基因轉(zhuǎn)錄能力。這些資料說明p53、bax-2和bax等凋亡調(diào)劑因子在腫瘤細(xì)胞 的耐藥機(jī)

10、制中起重要作用，但作用方式是復(fù)雜多樣的。2 p53對耐藥蛋白的調(diào)劑作用P53具有不同結(jié)構(gòu)區(qū)域。wt-p53與DNA共有區(qū)結(jié)合后，能正向調(diào)劑一系列下游基因的表達(dá)。另外，wt-始負(fù)向調(diào)劑許多缺乏wt-p53共有區(qū)結(jié)合位點(diǎn)基因，包括DA topo II a、皿RI、c-fos和其它病毒 和細(xì)胞的啟動子。p53對多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)表達(dá)的調(diào)劑轉(zhuǎn)錄因子spl是MRP基因啟動子的強(qiáng)興奮劑，wt-始與spl 結(jié)合，排除spl作用，從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)劑MRP表達(dá)。Wang13將帶有蟲 熒光素酶標(biāo)記報告基因的MRP啟動子與wt-p53 一起轉(zhuǎn)染p53陰性的人 類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1299和鼠(10) 1細(xì)胞，

11、結(jié)果顯示wt-p53能 呈劑量依托性地顯著抑制MRP啟動子活性，wt-忍氣吞聲作用位點(diǎn)為 -91至lJ+103bp,該處有數(shù)個spl結(jié)合位點(diǎn)；而突為型p53只有很弱的 作用。同時研究還發(fā)覺wt-P53還能抑制高表達(dá)MRP的CEM/VM-1-5細(xì) 胞的內(nèi)源性MRP表達(dá)。0shika14采納免疫組化技術(shù)檢測107例非小 細(xì)胞肺癌標(biāo)本，MRP和突變型P53表達(dá)有明顯相關(guān)性，雙染色技術(shù)顯 示p53和MRP在一些細(xì)胞上同時表達(dá)，這些病人預(yù)后明顯羅無MRP和 突變型p53患者差。P53CF p-糖蛋白(P-gp)表達(dá)的調(diào)劑P-gp是有MDR1基因編碼的多藥耐藥蛋白。wt-作用于MDR1 下游啟動子，從轉(zhuǎn)錄

12、水平P-gp的表達(dá)。Straussp15將wt-p53與由 MDR1下游啟動子操縱的報告分子一起轉(zhuǎn)染BHK和Sacs-2細(xì)胞株，發(fā) 覺wt-p53呈劑量依托性MDR1基因啟動子活性。Strauss 16在另一研 究中發(fā)覺部份P53的突變體能激活MDR2基因下游啟動子轉(zhuǎn)錄活恪，他 將這種P53突變稱為“取得功能性突變:Linn17采納雙重免疫組化 染色，核P53聚集和P-gp表達(dá)常常發(fā)生在同一腫瘤細(xì)胞，且這種情形 在浸潤進(jìn)展期的乳腺癌中更易見到。其推測一起表達(dá)突變型p53和 P-gp屬于一系列分子事件，能致使腫瘤浸潤、藥物耐受，產(chǎn)生不良預(yù) 后。3其它凋亡調(diào)劑因子對耐藥蛋白的調(diào)劑作用Bcl-2與P

13、-gp作用尚不明確，但Eid20采納免疫組化分析 70例人睪丸腫瘤Bcl-2和P-gp表達(dá),BclO-2和P-gp存在明顯的相關(guān) 性（P二）。C-myc癌基因?yàn)橐环N參與細(xì)胞分化和惡性增殖的核蛋白型癌 基因，具有促使DNA復(fù)制的功能，可在一些致癌因素作用下（如病毒、 放射性和化學(xué)誘變劑）發(fā)生基因重排和擴(kuò)增而得以活化。C-myc基因 表達(dá)既可增進(jìn)細(xì)胞增殖又可促使細(xì)胞凋亡，這種彼此對立的作用受生 長因子等調(diào)控。C-myc與P-gp的關(guān)系還不清楚，但有報告采納Southern印 記雜交分析，發(fā)覺同一惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生C-myc基因重排及MDR1 基因限制性片段擴(kuò)增現(xiàn)象，推測C-myc基因活性MDR1

14、基因的轉(zhuǎn)變和腦 膠質(zhì)瘤耐藥株的耐藥性可能存在較為緊密的關(guān)系。但另一作者采納免 疫組化方式研究67例胃癌標(biāo)本中p53> C-myc和P-gp的表達(dá)，P53的 異樣表達(dá)與P-gp表達(dá)呈顯著正相關(guān)（，P<）, C-myc和P-gp的表達(dá)無 明顯相關(guān)。N-myc也編碼一個調(diào)劑轉(zhuǎn)錄的核酸化蛋白。N-myc基因的擴(kuò)增 與MRP表達(dá)增加有關(guān)。Bordow19采納Rt-PCR觀看25例神經(jīng)母細(xì)胞 瘤標(biāo)本，N-myc基因擴(kuò)增的標(biāo)本，MRP基因表達(dá)水平亦明顯增高（P=）, 而YDR1基因表達(dá)與N-myc癌基因擴(kuò)增無明顯關(guān)系。采納N-myc癌基因 抑制劑RA研究神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SYSY和BE （

15、2） -C, RA抑制 "myc基因表達(dá)后，MRP表達(dá)隨之下降（P-=）,而MDR1基因表達(dá)量卻 增加（POo Norris20分析60例原發(fā)性神經(jīng)母細(xì)胞瘤標(biāo)本，亦發(fā)此刻N(yùn)-myc擴(kuò)增的腫瘤，MRP表達(dá)水平明顯增(P<)。Kopnin2分析人ras基因?qū)DRlmRNA和P-gp表達(dá)阻礙。ras 基因除能激活外源性MDR1基因啟動子外，還能引發(fā)內(nèi)源性MDRlmRXA 水平升高，P-gp活性增加并使Rhodaminel23外排增多，細(xì)胞對秋水 仙素和其它一些化療藥物的耐藥性亦增加。Chin22研究發(fā)覺人MDR1 基因啟動子也是ras癌基因的靶位點(diǎn),盡管其產(chǎn)物對MDR1基因的正向

16、調(diào)劑是非特異的，但與突變型P53有協(xié)同作用，而wt-p53無此作用。4多藥耐藥性研究進(jìn)展最近研究資料發(fā)覺耐藥蛋白的表達(dá)與其啟動子甲基化狀態(tài)有 關(guān)。Nakayama23采納定量Rt-PCR檢測42例急性白血病標(biāo)本，發(fā)覺 MDR1基因啟動子上CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)與MDR1基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。 推測MDR1基因表達(dá)的必需條件。Kantharids24在T細(xì)胞白血病細(xì)胞 株，采納甲基化靈敏和甲基化不靈敏的限制酶進(jìn)行Southern雜交分 析，MDR現(xiàn)象與MDR1基因5'端去甲基化明顯相關(guān)。采納去甲基化因 子5' 一氮脫氧嗦咤醫(yī)治P-gp表達(dá)陰性和陽性細(xì)胞株排除MDRlmRNA 表達(dá)，可增

17、加細(xì)胞對表柔比星(daunomycin)的耐受性。另外一些研究發(fā)覺非細(xì)胞毒性劑量的一些基因毒性藥物，專 門是DNA交聯(lián)因子，優(yōu)先改變可誘導(dǎo)的基因表達(dá)，這些作用要緊發(fā)生 在轉(zhuǎn)錄水平并引發(fā)暫不時性的DXA損傷。Ihuat25發(fā)覺DNA烷化劑絲 裂霉素C能明顯MDRlmRNA及P-gp表達(dá)，并減少藥物外輸，對ADM耐 受性減少到5到10倍。亞細(xì)胞毒性的CDDP也有此功能。在單層和球 形培育的人和嚙齒動物的結(jié)腸癌、乳腺癌、白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和 肝癌細(xì)胞株都觀看到此現(xiàn)象。Kimsh26研究發(fā)覺MDR1基因啟動子含有熱休克應(yīng)答元件， 能與熱休克反映元件結(jié)合，采納榭皮素(quereetin)抑制熱休克應(yīng)答

18、 元件與應(yīng)答因子間的結(jié)合，能逆轉(zhuǎn)MDR1介導(dǎo)的耐藥性。由于細(xì)胞凋亡的相關(guān)調(diào)劑因子介入多藥耐藥機(jī)制，使得腫瘤 細(xì)胞對化療藥物耐受機(jī)制加倍錯綜復(fù)雜。因此，在腫瘤細(xì)胞耐藥性研 究中，應(yīng)從多角度、全方位考慮，才能制定出羅好的醫(yī)治方案。另外, 對凋亡調(diào)劑因子介導(dǎo)耐藥機(jī)制的研究，可通過增強(qiáng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途 徑克服耐藥性。為惡性腫瘤的基因醫(yī)治提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。參考文獻(xiàn)1 Miyashita T and Reed J Bolld, 1993;81:1511572 Huschtscha L,Bartier WA, Eoss CE, etJcancer, 1996;73:54603 MalcomsonRDG, O

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