冰凍切片步驟很全面

1、歐陽生創(chuàng)編2021.02.08冰凍切片是指將組織 在冷凍狀態(tài)下直接用切片 機(jī)切片。它實(shí)際上是以水為 包埋劑將組織進(jìn)行冰凍至 堅(jiān)硬后切片的。在冰凍切片 前組織不經(jīng)過任何化學(xué)藥 品處理或加熱過程，大大縮 短了制片時(shí)間。同時(shí)，由于 此法不需要經(jīng)過脫水、透明 和浸蠟等步驟，因而較適合 于脂肪、神經(jīng)組織和一些組歐陽生創(chuàng)編2021.02.08織化學(xué)的制片并作為快速 切片的方法應(yīng)用在臨床診 斷。時(shí)間：2021.02.08創(chuàng)作人：歐陽生1. 取材：應(yīng)盡可能快地采取新鮮的材料,防止組織發(fā)生死后變化。2. 速凍：為了較好地保存細(xì)胞內(nèi)的酶活性或盡快制成切片標(biāo)本 的需要，一般在取材后就要立刻對(duì)組織塊進(jìn)行速凍，使組織

2、溫度驟降,縮短降溫的時(shí)間,減少冰晶的形成。液氮速凍切片法是實(shí)驗(yàn)室最常用的速凍切片方法。具體 做法是將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)（直徑約 2cm ）,如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織,然后將 特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi),當(dāng)盒底部接觸液氮 時(shí)即開始?xì)饣序v,此時(shí)小盒保持原位切勿浸入液氮中,大 約020s組織即迅速冰結(jié)成塊。在制成凍塊后,即可置入 恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。若需要保存,應(yīng)快速以鋁箔或塑料 薄膜封包，立即置入8（rc冰箱貯存?zhèn)溆?。歐陽生創(chuàng)編2021.02.083固走:樣品托上涂一層OCT包埋膠M各速凍組織置于其上z4°c 冰箱預(yù)冷5-10min讓OCT膠浸透組

3、織。取下組織置于錫箔或者玻片上，樣品托速凍。組織置于樣品托上,其上再添一層OCT膠，以完全覆 蓋為宜，速凍架（PE）上30min。4切片：恒溫冰凍切片機(jī)為較理想的冰凍切片機(jī),其基本結(jié)構(gòu)是 將切片機(jī)置于低溫密閉室內(nèi),故切片時(shí)不受外界溫度和環(huán)境 影響,可連續(xù)切薄片至5-10pme切片時(shí)，低溫室內(nèi)溫度以 -15°C 20°C為宜，溫度過低組織易破碎，抗卷板的位置及 角度要適當(dāng),載玻片附貼組織切片，切勿上下移動(dòng)。切好室 溫放置30min后，入4°C丙酮固定510min ,烘箱干燥 20mine PBS洗5minx3e進(jìn)行抗原熱修復(fù)，微波熱修復(fù)也 可，室溫自然冷卻?？捎?%

4、H2O2孵育510min ,消除內(nèi) 源性過氧化物酶的活性。5.免疫熒光染色：冰凍切片室溫晾干15minzRj用含10%正常山羊血清的 PBS室溫封閉切片1小時(shí)（此步可不洗）滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液（抗體的量視組 織大小而走,原則是可以均勻覆蓋組織面,且保證整個(gè)過程 中不會(huì)使組織干涸），將切片放在加了 PBS的免疫組化濕盒,歐陽生創(chuàng)編2021.02.08室溫孵育2小時(shí)或4工過夜。第二天先將濕盒放到37°C回溫1h ,然后吸取片上的一 抗進(jìn)行回收,將切片插入到小染缸PBS沖洗。滴加用PBS稀釋好的二抗（避光）置于分子雜交箱中 37°C孵育1小時(shí)。回收二抗，切片置于染缸內(nèi),PBS洗5minx3次。滴加DAPI工作液染核 室溫10-20min（I作濃度0.1 % 染色 15min）?；厥誅API,滴加510pl抗熒光衰減封片劑或中性樹膠, 用處理干凈的蓋玻片封片,即可到熒