20章基因工程

1、基因工程基因工程InsertionCrossingover轉導轉導Transduction:Transduction: 由病毒介導的由病毒介導的DNADNA由一個細胞向另一個細由一個細胞向另一個細胞轉移的現象。隨后胞轉移的現象。隨后DNADNA會整合到受體細會整合到受體細胞的基因組中。胞的基因組中。 識別識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈切割雙鏈DNA的一類內切酶，與相伴的甲基化酶共的一類內切酶，與相伴的甲基化酶共同構成細菌防御機制同構成細菌防御機制限制修飾體系（限制外源限制修飾體系（限制外源DNA，保護自身保護自身DNA） Hin d 流感噬血

2、桿菌種屬流感噬血桿菌種屬 d 株株 第三種內切酶第三種內切酶限制性核酸內切酶命名：限制性核酸內切酶命名： 屬名、種名、株名屬名、種名、株名限制性核酸內切酶（限制性核酸內切酶（restriction endonuclease）切割切割DNA后有后有粘端與平端粘端與平端之分或產生之分或產生平末端平末端識別位點常為識別位點常為4-6個堿基對、具有個堿基對、具有回文結回文結構構的的DNA片段片段 AATGAATTCGTACCG TTACTTAAGCATGGC限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶5-NGAATTCN-33-NCTTAAGN-55-NG AATTCN-33-NCTTAA GN-5粘粘末末端端(

3、Cohensive end or sticky end）5突出端突出端EcoR15-NCAG CTGN-33-NGTC GACN-55-NCAG CTGN-33-NGTC GACN-5平末端平末端Pvu 2（blunt end）錯位切割錯位切割垂直切割垂直切割基因工程其他常用的工具酶基因工程其他常用的工具酶酶的酶的種類種類功功 能能DNA連接酶連接酶催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5磷酸基和磷酸基和3羥基末端之間羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個切口封合或使兩個DNA分子或片段連接分子或片段連接DNA聚合酶聚合酶 I合成雙鏈合成雙鏈cDNA的第二條鍵的第二條鍵

4、缺口平移制作高比活探針缺口平移制作高比活探針DNA序列分析序列分析填補填補3末端末端反轉錄酶反轉錄酶以以RNA為模板合成為模板合成cDNA第一鏈第一鏈多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標記探針羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶末端轉移酶 在在3羥基末端進行同質多聚物加尾羥基末端進行同質多聚物加尾切除末端磷酸基團切除末端磷酸基團堿性磷酸酶堿性磷酸酶Taq DNA聚合酶聚合酶 PCR擴增擴增 載體（載體（vectorvector）是由在細胞中是由在細胞中能夠自主復制的分子構成的能夠自主復制的分子構成的一種遺傳成分，通過實驗手段可使一種遺傳成分，通過實驗

5、手段可使其它片段其它片段( (外源基因外源基因) )連接在它連接在它的上面，進行擴增或表達。的上面，進行擴增或表達。（一）（一） 質粒（質粒（plasmidplasmid）載體載體 質粒是一種獨立于染色體外的小分子環(huán)狀質粒是一種獨立于染色體外的小分子環(huán)狀DNADNA，一般大小約一般大小約10106 610108 8D D，可自身復制和表可自身復制和表達，有的質粒還帶有可做為選擇性標記的抗藥達，有的質粒還帶有可做為選擇性標記的抗藥性基因，所以質粒經過適當改選后便可成為良性基因，所以質粒經過適當改選后便可成為良好的載體。好的載體。 作為載體的質粒大多是由天然質粒經人工適作為載體的質粒大多是由天然質

6、粒經人工適當改造而成的，目前已有多種經改造的良好的當改造而成的，目前已有多種經改造的良好的質粒載體。質粒載體。質粒（質粒（plasmidplasmid） 是存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈是存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNADNA 分子。大小約為分子。大小約為 數千堿基對。常數千堿基對。常 有有1 31 3個抗藥個抗藥 性基因，以利于性基因，以利于 篩選。篩選。質粒載體質粒載體1. 1. 克隆克隆的的質粒載體質粒載體2.2. 允許外源的允許外源的DNADNA插入，儲存。主插入，儲存。主要是要是DNADNA水平上的操作。水平上的操作。2.2.基因表達的質粒載體基因表達的質粒載體3.3. 允許

7、外源允許外源DNADNA的插入、儲存和表的插入、儲存和表達。達。LOCSC重要的大腸桿菌質粒載體重要的大腸桿菌質粒載體 1 1、pBR322pBR322質粒載體；質粒載體； 2 2、pUCpUC質粒載體；質粒載體；以Ampr和Tetr為選擇性標記，克隆位點在這兩個選擇性標記的單酶切位點上。（4363bp）oripBR322pBR322的結構來源的結構來源 一種典型的一種典型的pUCpUC系列的質粒載體，系列的質粒載體，包括以下四個部分：包括以下四個部分： 1 1、來自、來自pBR322pBR322質粒的復制起點（質粒的復制起點（oriori）；）； 2 2、氨芐青霉素抗性基因（氨芐青霉素抗性基

8、因（ampampr r ）, ,但它的但它的DNADNA核苷酸序列已經發(fā)生了變化，不在含有原核苷酸序列已經發(fā)生了變化，不在含有原來的核酸內切限制酶的但識別位點。來的核酸內切限制酶的但識別位點。 3 3、大腸桿菌、大腸桿菌- -半乳糖基因（半乳糖基因（lacZlacZ）的啟動子的啟動子及編碼及編碼- -肽鏈的肽鏈的DNADNA序列，此結構稱之為序列，此結構稱之為lacZlacZ基因；基因； 4 4、位于、位于lacZlacZ基因中的靠近基因中的靠近5-5-端的一段多端的一段多克隆位點（克隆位點（MCSMCS）區(qū)段。但它并不破壞該基因區(qū)段。但它并不破壞該基因的功能。的功能。AmproripUC18

9、(3 kb)MCS (Multiple cloning sites,多克隆位點）多克隆位點）Lac promoterlacZMCS (Multiple cloning sites,多克隆位點）：多克隆位點）：指人工合指人工合成的含有多種限制性內切酶單一識別切割位點的成的含有多種限制性內切酶單一識別切割位點的DNA序列。序列。乳糖操縱子結構與調控模式圖穿梭質粒載體（ shuttle plasmid vector ） 是指一類由人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇記號，因而可在兩種不同的寄主細胞存活和復制的質粒載體。早期發(fā)現的大腸桿菌早期發(fā)現的大腸桿菌- -枯草桿菌穿梭枯草桿菌穿梭質粒載體質粒載體

10、大腸桿菌大腸桿菌- -釀酒酵母穿梭質粒載體釀酒酵母穿梭質粒載體大腸桿菌大腸桿菌- -牛乳頭瘤病毒牛乳頭瘤病毒迄今還沒有發(fā)展出適用的大腸桿菌迄今還沒有發(fā)展出適用的大腸桿菌- -植物細胞穿梭載體。植物細胞穿梭載體。噬菌體噬菌體載體載體 噬菌體噬菌體基因組長基因組長48.5 kb基因組可為線狀和基因組可為線狀和環(huán)狀兩種形式環(huán)狀兩種形式 (cos ends) 溶菌階段溶菌階段 溶源階段溶源階段5-CGGGGCGGCGACCTCG-33-GCCCCGCCGCTGGAGC-5 剪切 連接 (包裝過程) (侵染細菌細胞后) GGGCGGGCGACCTCG-35-CG + GC-53-GCCCCGCCGCTG

11、GAThe phage cos ends環(huán)狀環(huán)狀 線狀線狀 A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam red cIII NCOS COS 頭部基因頭部基因 尾部基因尾部基因 功能不明區(qū)功能不明區(qū) 溶源化溶源化 重組重組 早期控制早期控制 阻遏阻遏 DNADNA合成合成 溶菌溶菌生長非必須區(qū)段生長非必須區(qū)段cI cI基因：溶源過程控制基因?；颍喝茉催^程控制基因。噬菌體的基因組結構噬菌體的基因組結構體外包裝體外包裝 噬菌體噬菌體DNADNA體外重組后，一般必須經過體外重組后，一般必須經過體外

12、包裝，然后以噬菌體感染的方式將重組體外包裝，然后以噬菌體感染的方式將重組DNADNA導入導入E.coliE.coli細胞內。這是因為以細胞內。這是因為以感染感染方式方式導入細胞的頻率可達導入細胞的頻率可達10106 610108 8/gDNA/gDNA， 噬菌體的噬菌體的包裝限制包裝限制為野生噬菌體為野生噬菌體DNADNA（約約48.5 kb48.5 kb）的的75%105%75%105%。 由于由于噬菌體包裝時，當DNA的長度短于野生型的78%或超過105%時，噬菌體的活性就急劇下降。因此只包裝它的野生型DNA（48.5KB）的75%105%左右的，要求載體DNA和外源DNA長度之和在395

13、3kb之間。DNAProtein coatcoscosNonessential regionLong (left)armshort (right)armExogenous DNA(20-23 kb) phage12bp插入式載體：插入式載體： cI cI基因插入失活基因插入失活：如：如 gt10 gt10等載體，在等載體，在cI cI基因上有基因上有EcoEcoR R I I及及HinHind IIId III的酶切位點。外源基因插入后將導致的酶切位點。外源基因插入后將導致cI cI基因的基因的失活。失活。cI cI基因失活后將導致噬菌體不能溶原化，產生清晰基因失活后將導致噬菌體不能溶原化，產

14、生清晰的噬菌斑。相反，產生混濁的噬菌斑。的噬菌斑。相反，產生混濁的噬菌斑。 Lac ZLac Z基因插入失活基因插入失活：如：如charon16Acharon16A載體，在非必須區(qū)段載體，在非必須區(qū)段引入引入laclac Z Z基因，在基因，在laclac Z Z基因上有基因上有EcoEcoR R I I位點，插入失活后位點，插入失活后利用利用X-galX-gal法篩選（蘭白篩選）。法篩選（蘭白篩選）。 cIEcoR I LA 32.7RA10.6 gt 10 lac ZLA 19.9RA21.9EcoR I Charon 16A 替換型載體（取代型載體）l 外源外源DNADNA取代噬菌體染色

15、體中對于噬菌體的取代噬菌體染色體中對于噬菌體的感染和復制非必需的片段感染和復制非必需的片段 ( (約約20 kb20 kb) )l 這些載體是用這些載體是用Lac 5Lac 5（乳糖操縱子的大部分（乳糖操縱子的大部分系列，包括完整的系列，包括完整的Lac ZLac Z）替換入噬菌體的）替換入噬菌體的中間區(qū)段，同時將中間區(qū)段，同時將Lac 5Lac 5作為選擇標記，使作為選擇標記，使用時用用時用EcoEcoR R水解，去掉中間的片段，再水解，去掉中間的片段，再與欲克隆片段在體外進行重組、包裝。而與欲克隆片段在體外進行重組、包裝。而后，感染后，感染E.coliE.coli使之在使之在E.coliE

16、.coli內繁殖，并內繁殖，并裂解裂解E.coliE.coli，形成空斑。，形成空斑。如如 EMBL系列系列Lac 5 EcoR I EcoR IEcoR I BanH I Sal I Sal I BamH I EcoR I MCS MCS Charon 4AEMBL3/4Charon 40替換型載體克隆外源替換型載體克隆外源DNADNA的步驟的步驟1. 應用適當的核酸內切酶消化載體， 除去可取代的DNA片段； 2. 將上述所得的 DNA載體臂同外源 DNA片段的連接； 3. 對重組體的DNA分子進行包裝和增 殖，以得到有感染性的重組噬菌體（左右臂連接） （三段自身連接） （插入片段） 根據噬

17、菌斑的透明度或顏色來進行重組子的篩選根據噬菌斑的透明度或顏色來進行重組子的篩選（黏性質粒）柯斯質粒載體（黏性質粒）柯斯質粒載體柯斯質粒載體柯斯質粒載體cosmidcosmid載體載體：也稱粘粒、柯斯載體。這是一類用于克隆大片段DNA的載體，它是由噬菌體的cos（cohesive site）末端及質粒（plasmid）重組而成的載體。cosmid載體帶有質粒的復制起點、克隆位點、選擇性標記以及噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導入受體細胞。但它不會產生子代噬菌體，而是以質粒DNA的形式存在于細胞內。 設計

18、構建的柯斯質粒一般長46kb。其上的cos位點的一個重要作用是識別噬菌體的外殼蛋白。凡具有cos位點的任何DNA分子只要在長度相當于噬菌體基因組，就可以同外殼蛋白結合而被包裝成類似噬菌體的顆粒。因此，插入柯斯質粒的外源DNA可大于40kb。重組的柯斯質粒可象噬菌體一樣感染大腸桿菌，并在細菌細胞中復制?？滤官|粒pHC79系由質粒pBR322和噬菌體的cos位點的一段DNA構成全長4.3kb單鏈DNA噬菌體載體 (M13)M13M13噬菌體載體噬菌體載體 M13M13是一種含單鏈（是一種含單鏈（+ +）DNADNA（ssDNAssDNA）的的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為絲狀大腸桿菌噬菌體，其

19、基因組大小為6.4kb6.4kb。這類載體主要用來獲得大量的單鏈片段，這類載體主要用來獲得大量的單鏈片段，這種單鏈片段在遺傳學研究中主要用來這種單鏈片段在遺傳學研究中主要用來測定序列（測定序列（sangersanger雙脫氧法）、基雙脫氧法）、基因的因的定點突變研究、異源雙鏈定點突變研究、異源雙鏈DNADNA的分析等。的分析等。 RF DNAM13M13載體載體 具有多克隆位點(MCS)，方便克隆。許多M13載體的多克隆位點與質粒載體pUC序列的多克隆位點是相同的，在克隆位點選擇上更為方便。 可以定向地克隆DNA片段，克隆在M13 RF DNA分子上的雙鏈DNA片段，到了子代噬菌體便成了單鏈的

20、形式。所以如果要同時分離分子中的雙鏈，則需要兩種獨立的克隆。Blue-white selection M13M13克克隆載體隆載體分子結分子結構圖構圖噬菌粒載體噬菌粒載體T7T3用于體外轉錄（三）其他載體（三）其他載體酵母人工染色體載體酵母人工染色體載體 （yeast artificial chromosome, YACyeast artificial chromosome, YAC） 細菌人工染色體細菌人工染色體 （bacterial artificial chromosome, BACbacterial artificial chromosome, BAC）動物病毒動物病毒DNADNA改造

21、的載體（如腺病毒、腺病毒相改造的載體（如腺病毒、腺病毒相關病毒、逆轉錄病毒）關病毒、逆轉錄病毒） 人基因組十分龐大，約含3109bp，建立和篩選人的基因組文庫，要求有容量更大的載體，酵母人工染色體（yeast artificial chromosome,YAC）載體應運而生。YAC含有酵母染色體端粒（telesome）、著絲點(centromere)及復制起點等功能序列，可插入長度達200-500kb的外源DNA，導入酵母細胞可以隨細胞分裂周期復制繁殖供作克隆，成為人基因組研究計劃的重要載體。正常酵母人工染色體含有：正常酵母人工染色體含有：* 四膜蟲端粒（四膜蟲端粒（tel)* 酵母自主復制序

22、列（酵母自主復制序列（ARS)* 酵母著絲點酵母著絲點 (CEN)* 酵母的選擇標記酵母的選擇標記 (TRP1、URA1)YAC載體載體 質粒和噬菌體載體只能在細菌中繁殖，不能滿足真核DNA重組需要。感染動物的病毒可改造用作動物細胞的載體。由于動物細胞的培養(yǎng)和操作較復雜、花費也較多，因而病毒載體構建時一般都把細菌質粒復制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細胞。目前病毒載體常用者有改造來自猴腎病毒SV40（Simian Virus 40）、逆轉錄病毒和昆蟲桿狀病毒等，使用這些病毒載體的目的多為將目的基因或序列放入動物細胞中表達或試驗其功能、或作基

23、因治療等。載體的種類和特征載體的種類和特征四種常用載體的比較* * 外源外源DNADNA如超過如超過10kb10kb，則重組質粒的轉化率和則重組質粒的轉化率和DNADNA得率都非常低得率都非常低* * * 已有個別材料可用于此目的已有個別材料可用于此目的表達載體：表達載體： 按特殊設計構建的，按特殊設計構建的，能使克隆在其中特定位點的外源能使克隆在其中特定位點的外源真核基因的編碼序列，在大腸桿真核基因的編碼序列，在大腸桿菌細胞中正常轉錄并轉譯成相應菌細胞中正常轉錄并轉譯成相應蛋白質的克隆載體。蛋白質的克隆載體。 核糖體結合位點核糖體結合位點啟動子啟動子轉錄終止子轉錄終止子復制復制起點起點 噬菌

24、體的阻遏物操作系統(tǒng)噬菌體的阻遏物操作系統(tǒng) 真核表達載體的構建有：真核表達載體的構建有：u原核生物的序列，來自質粒的復制原核生物的序列，來自質粒的復制起始序列、抗生素抗性標記基因。起始序列、抗生素抗性標記基因。u真核生物表達調控的元件，包括啟真核生物表達調控的元件，包括啟動子，增強子、轉錄終止和動子，增強子、轉錄終止和polyApolyA加尾加尾信號。信號。u真核細胞的復制起始序列，可篩選真核細胞的復制起始序列，可篩選標記基因等。標記基因等。 主要包括質粒載體和病毒載體，使主要包括質粒載體和病毒載體，使用的調控表達元件最初多來源于病毒用的調控表達元件最初多來源于病毒SV40SV40病毒載體病毒載

25、體逆轉錄病毒載體逆轉錄病毒載體腺病毒載體腺病毒載體腺相關病毒載體腺相關病毒載體1. 用用PCR技術獲取基因技術獲取基因2. 用用RT-PCR（逆轉錄逆轉錄-PCR）獲得基因獲得基因3. 從基因組文庫或從基因組文庫或cDNA文庫中獲取基因文庫中獲取基因4人工合成基因人工合成基因是根據是根據DNA半保留復制和半保留復制和DNA聚合酶的特性建立聚合酶的特性建立起來的體外復制擴增起來的體外復制擴增DNA片段的技術片段的技術1.用用PCR技術獲取基因技術獲取基因（聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應, , polymerase chain reaction）Kary B.Mulis 1985年發(fā)明年發(fā)明,獲獲1

26、993年諾貝爾化學獎年諾貝爾化學獎可將微量的目的可將微量的目的DNA在體外擴增在體外擴增100萬倍以上萬倍以上PCR技術技術模板為模板為mRNA需逆轉錄酶需逆轉錄酶產物為產物為cDNART-PCR與與PCR區(qū)別區(qū)別基因文庫基因文庫gene library基因組文庫的構建基因組文庫的構建機械法或限制性機械法或限制性內切酶切割內切酶切割cDNA文庫的構建文庫的構建基因文庫構建示意圖基因文庫構建示意圖 已知目的基因的堿基序列可用已知目的基因的堿基序列可用DNA合成儀合成儀合成基因片段，然后用其他反應將基因片段合成基因片段，然后用其他反應將基因片段連接起來連接起來優(yōu)點優(yōu)點可修飾基因可修飾基因 可在基因

27、兩端設計接頭可在基因兩端設計接頭可選擇各種宿主生物偏愛的密碼子可選擇各種宿主生物偏愛的密碼子1. 根據克隆片段的大小。根據克隆片段的大小。2. 根據實驗目的（表達或擴增）根據實驗目的（表達或擴增）等等等等4 4. . 加人工接頭連接加人工接頭連接 人工接頭（人工接頭（linkerlinker，接頭）接頭）是指人是指人工合成的，連接目的基因兩端的含有某些限工合成的，連接目的基因兩端的含有某些限制酶位點的寡核苷酸片段，如含制酶位點的寡核苷酸片段，如含EcoREcoR的的linkerlinker與目的基因的連接圖（與目的基因的連接圖（p371p371）。）。5 5. . 聚合酶鏈反應特異引物連接聚合

28、酶鏈反應特異引物連接 利用利用PCRPCR技術，將技術，將PCRPCR引物的引物的55端端加上限制性內切酶的切點。加上限制性內切酶的切點。載體載體PucPuc系列（系列（PUC18/19PUC18/19）帶有帶有E.coliE.coli DNA DNA的短區(qū)段，含：的短區(qū)段，含： (1) (1) Lacz(NLacz(N) )即編碼即編碼半糖苷酸半糖苷酸N N端的端的 146146個個AAAA信息也稱信息也稱多肽；多肽； (2)(2)編碼區(qū)插入一個編碼區(qū)插入一個MCSMCS并不破壞閱讀框，使少數幾個并不破壞閱讀框，使少數幾個AAAA插入插入到到 該酶的該酶的 N N端而不影響其功能；端而不影響

29、其功能； (3)Plac(3)Plac可以啟動可以啟動LaczLacz的的 轉錄，表達，但受阻轉錄，表達，但受阻pr.pr.阻遏，阻遏，IPTGIPTG（異丙基硫代異丙基硫代半乳糖苷）能夠去阻遏。半乳糖苷）能夠去阻遏。JM103JM103受體菌含受體菌含lacz(clacz(c) )可以編碼可以編碼半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的 C C端部分端部分互補互補 當載體轉入當載體轉入JM103 lacz(n)與與lacz(clacz(c) ) 互補，編碼互補，編碼具有活性酶具有活性酶prpr使底物使底物X-galX-gal生色（生色（5 5溴溴4 4氯氯3 3吲哚吲哚半乳糖苷產半乳糖苷產生蘭菌落）。生蘭菌落）。當當MCSMCS插入外源插入外源genegene片斷時，幾乎無