儀器分析毛細管電泳法ppt課件

1、 第五章第五章 毛細管電泳法毛細管電泳法Capillary Electrophoresis 本章要求本章要求 了解電泳、淌度、電滲的概念了解電泳、淌度、電滲的概念 了解毛細管電泳儀的結(jié)構(gòu)了解毛細管電泳儀的結(jié)構(gòu) 了解六種毛細管電泳分離模式了解六種毛細管電泳分離模式 毛細管電泳capillary electrophoresis，CE又稱高效毛細管電泳HPCE），是以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力的液相分離技術(shù)。 CE 實際上包含電泳、色譜及其交叉內(nèi)容，使分析化學(xué)得以從微升水平進入納升水平，并使單細胞分析，乃至單分子分析成為可能。生物大分子如蛋白質(zhì)的分離分析也因此有了新的轉(zhuǎn)機。5.1 基本

2、概念和原理基本概念和原理 在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子在直流電場的作用下，以在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子在直流電場的作用下，以不同的速度或速率向其所帶電荷相反電場方向遷移的現(xiàn)不同的速度或速率向其所帶電荷相反電場方向遷移的現(xiàn)象。陰離子向正極方向遷移，陽離子向負極方向遷移，象。陰離子向正極方向遷移，陽離子向負極方向遷移，中性化合物不帶電荷，不發(fā)生電泳運動。中性化合物不帶電荷，不發(fā)生電泳運動。 利用這些帶電粒子在電場中遷移速度的不同而達到分利用這些帶電粒子在電場中遷移速度的不同而達到分離的技術(shù)稱為電泳。離的技術(shù)稱為電泳。1. 電泳電泳2. 毛細管電泳：毛細管電泳：CE 以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細管為分離通道

3、，利用被分析以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細管為分離通道，利用被分析離子在電場作用下移動速率不同而達到分離的目的，主要用離子在電場作用下移動速率不同而達到分離的目的，主要用于分析在毛細管緩沖溶液中離解為離子的物質(zhì)。于分析在毛細管緩沖溶液中離解為離子的物質(zhì)。毛細管的內(nèi)徑比頭發(fā)絲還細得多10-30千伏電壓3. 淌度淌度淌度：單位電場下的電泳速度。淌度：單位電場下的電泳速度。絕對淌度：在無限稀釋溶液中稀溶液數(shù)據(jù)外推測絕對淌度：在無限稀釋溶液中稀溶液數(shù)據(jù)外推測得的淌度稱為絕對淌度，得的淌度稱為絕對淌度，0em電泳速率：待測物從進樣端到檢測窗口的遷移速度，電泳速率：待測物從進樣端到檢測窗口的遷移速度，vem=

4、 =vEemem em：cm2/(s V)； vem ：cm/s； E：V/cm4. 電滲電滲毛細管內(nèi)充滿溶液毛細管內(nèi)充滿溶液 pH 3時，管內(nèi)時，管內(nèi) Si-OH 電離電離 SiO- 基，基，毛細管壁帶負電，與溶質(zhì)界面上形成雙電層。在雙電層的毛細管壁帶負電，與溶質(zhì)界面上形成雙電層。在雙電層的擴散外層中，陽離子向陰極移動，帶動溶液形成軸向流動。擴散外層中，陽離子向陰極移動，帶動溶液形成軸向流動。在毛細管中電滲速度可比電泳速度大一個數(shù)量級，所以能在毛細管中電滲速度可比電泳速度大一個數(shù)量級，所以能實現(xiàn)樣品組分同向泳動。正離子的運動方向和電滲流一致，實現(xiàn)樣品組分同向泳動。正離子的運動方向和電滲流一致

5、，最先流出；中性粒子的電泳流速度為最先流出；中性粒子的電泳流速度為“零零”，其遷移速度，其遷移速度相當于電滲流速度；負離子的運動方向和電滲流方向相反，相當于電滲流速度；負離子的運動方向和電滲流方向相反，但因電滲流速度一般都大于電泳速度，在中性粒子之后流但因電滲流速度一般都大于電泳速度，在中性粒子之后流出，從而因各種粒子遷移速度不同而實現(xiàn)分離。出，從而因各種粒子遷移速度不同而實現(xiàn)分離。離子的出峰次序為：正離子離子的出峰次序為：正離子 中性分子中性分子 負離子負離子電滲流的作用：電滲流的作用： 可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離?？梢淮瓮瓿申栯x子、陰離子、中性粒子的分離。 改變電滲流的大小和

6、方向，可改變分離效率和選擇性，改變電滲流的大小和方向，可改變分離效率和選擇性，也是也是CE與與HPLC相比能優(yōu)化分離的重要因素。相比能優(yōu)化分離的重要因素。 電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性，控制電滲流恒定電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性，控制電滲流恒定是是CE分析關(guān)鍵所在。分析關(guān)鍵所在。 電滲流在電滲流在CE中起到像中起到像HPLC中的泵一樣作用。中的泵一樣作用。鉑電極鉑電極緩沖溶液緩沖溶液高壓電源高壓電源毛細管毛細管5.2 毛細管電泳裝置毛細管電泳裝置1. 進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)電動進樣；壓力進樣；擴散進樣。電動進樣；壓力進樣；擴散進樣。進樣體積一般在納升級。進樣體積一般在納升級。2. 分離系統(tǒng)分

7、離系統(tǒng)毛細管：毛細管： 熔融石英，長熔融石英，長40100 cm，內(nèi)徑，內(nèi)徑25100 m；恒溫系統(tǒng)：控制柱溫變化在恒溫系統(tǒng)：控制柱溫變化在0.1； 高壓電源：電流高壓電源：電流0300 A，電壓，電壓030 kV (穩(wěn)定性穩(wěn)定性0.1%)3. 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)4. 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)紫外紫外-可見檢測器可見檢測器 ；激光誘導(dǎo)熒光檢測器；電化學(xué)檢測器。；激光誘導(dǎo)熒光檢測器；電化學(xué)檢測器。5.3 毛細管電泳分離模式毛細管電泳分離模式6種分離模式：種分離模式： 毛細管區(qū)帶電泳毛細管區(qū)帶電泳CZE 毛細管等速電泳毛細管等速電泳CITP 毛細管等電聚焦毛細管等電聚焦CIEF 毛細管電色譜毛細管電

8、色譜CEC 膠束電動毛細管色譜膠束電動毛細管色譜MECC 毛細管凝膠電泳毛細管凝膠電泳CGE1. 毛細管區(qū)帶電泳毛細管區(qū)帶電泳 (CZE) 用用CZE時，整個系統(tǒng)用一種緩沖溶液時，整個系統(tǒng)用一種緩沖溶液 (背景電解質(zhì)背景電解質(zhì))，根據(jù)，根據(jù)各組分荷質(zhì)比不同而分離。背景電解質(zhì)僅起各組分荷質(zhì)比不同而分離。背景電解質(zhì)僅起傳導(dǎo)電流的作用。傳導(dǎo)電流的作用。 t 0 t 02. 毛細管等速電泳毛細管等速電泳CITP） 使用兩種電解質(zhì)：一種為遷移率較高的前導(dǎo)離子使用兩種電解質(zhì)：一種為遷移率較高的前導(dǎo)離子L電解質(zhì)，電解質(zhì)，一種為遷移率較低的尾隨離子一種為遷移率較低的尾隨離子T電解質(zhì)，被分離組分夾在電解質(zhì)，被分

9、離組分夾在L與與T之間，以同一速度運動，由于遷移率不同而分離。之間，以同一速度運動，由于遷移率不同而分離。3. 毛細管等電聚焦毛細管等電聚焦 (CIEF) 基本操作步驟：進樣、聚焦和遷移，用于生物大分子的分離?；静僮鞑襟E：進樣、聚焦和遷移，用于生物大分子的分離。酸酸酸酸堿堿堿堿毛細管等電聚焦電泳的運行過程毛細管等電聚焦電泳的運行過程 (a)進樣；進樣；(b)聚焦；聚焦；(c)遷移遷移4. 毛細管電色譜毛細管電色譜 (CEC) 分為填充柱和開管柱兩種方式，可分離離子和中性分子，且分為填充柱和開管柱兩種方式，可分離離子和中性分子，且可分離手性分子?？煞蛛x手性分子。5. 膠束電動毛細管色譜膠束電動

10、毛細管色譜 (MECC) 兩相：流動的水相和起固定相作用的膠束相兩相：流動的水相和起固定相作用的膠束相(準固定相準固定相)，被測組分由于在水相和膠束相之間分配系數(shù)的差異而分離。被測組分由于在水相和膠束相之間分配系數(shù)的差異而分離。5.4 毛細管電泳特點及應(yīng)用毛細管電泳特點及應(yīng)用(1) 高分辨率：理論塔板數(shù)高達數(shù)百萬塊至數(shù)千萬塊。高分辨率：理論塔板數(shù)高達數(shù)百萬塊至數(shù)千萬塊。(2) 高靈敏度：可檢測出低至高靈敏度：可檢測出低至10-20 mol濃度的物質(zhì)。濃度的物質(zhì)。(3) 高分析速度：可高分析速度：可3 min內(nèi)分離內(nèi)分離30種陰離子；種陰離子；1.7 min內(nèi)內(nèi)分離分離19種陽離子；種陽離子；4

11、 min內(nèi)分離內(nèi)分離10種蛋白質(zhì)。種蛋白質(zhì)。(4) 試樣用量少：僅需幾試樣用量少：僅需幾nL (10-9 L)的試樣。的試樣。(5) 儀器簡單，操作成本低：分析一個試樣僅需幾毫升。儀器簡單，操作成本低：分析一個試樣僅需幾毫升。(6) 自動：自動：CE是目前自動化程度最高的分離方法。是目前自動化程度最高的分離方法。(7) 通常使用水溶液，對人和環(huán)境無害。通常使用水溶液，對人和環(huán)境無害。1. 優(yōu)點優(yōu)點2eUND HPLC中，縱向擴散和傳質(zhì)阻力是影響譜峰展寬的重要因中，縱向擴散和傳質(zhì)阻力是影響譜峰展寬的重要因素，而素，而CE只有縱向擴散影響譜峰展寬，塔板數(shù)：只有縱向擴散影響譜峰展寬，塔板數(shù)：D: 組

12、分擴散系數(shù)組分擴散系數(shù)U：毛細管兩端施加電壓：毛細管兩端施加電壓可采用可采用2000060000V的高壓，分離速度和分離度有明顯的高壓，分離速度和分離度有明顯的改善，的改善，N為為(12)105，HPLC的的N為為51032104。理論塔板數(shù)理論塔板數(shù)(1) 進樣不夠方便。進樣不夠方便。(2) 分析陰離子時，出峰時間較長。電滲會因樣品組成而變分析陰離子時，出峰時間較長。電滲會因樣品組成而變化，影響分離重現(xiàn)性?；绊懛蛛x重現(xiàn)性。(3) 光路太短，非高靈敏度的檢測器難以測出樣品峰。光路太短，非高靈敏度的檢測器難以測出樣品峰。2. 缺陷缺陷毛細管電泳與高效液相色譜比較：毛細管電泳與高效液相色譜比較

13、： 操作簡單，試樣量少。操作簡單，試樣量少。 分離效率高，成本低。分離效率高，成本低。 遷移時間的重現(xiàn)性、進樣的準確性和靈敏度比遷移時間的重現(xiàn)性、進樣的準確性和靈敏度比HPLC差。差。3. 運用運用毛細管電泳技術(shù)不僅在基礎(chǔ)科學(xué)中得到廣泛應(yīng)用，在臨床毛細管電泳技術(shù)不僅在基礎(chǔ)科學(xué)中得到廣泛應(yīng)用，在臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域也有較多應(yīng)用，如臨床疾病診斷、臨床蛋白分醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域也有較多應(yīng)用，如臨床疾病診斷、臨床蛋白分析、臨床藥物監(jiān)測、代謝研究、病理研究、析、臨床藥物監(jiān)測、代謝研究、病理研究、PCR產(chǎn)物分析、產(chǎn)物分析、DNA片段及序列分析等。片段及序列分析等?？蓹z測多種樣品，如血清、血漿、尿樣、腦脊液、紅細胞、可檢測多種樣品，如血清、血漿、尿樣、腦脊液、紅細胞、體液或組織及其實驗動物活體實驗。體液或組織及其實驗動物活體實驗。除分離生物大分子肽、蛋白、除分離生物大分子肽、蛋白、 DNA、糖等外，還可、糖等外，還可用