食藥用真菌Agrocybeaegerita活性蛋白AAL抗腫瘤機(jī)理及新活性蛋白純化

1、食/藥用真菌Agrocybe aegerita 活性蛋白AAL抗腫瘤機(jī)理及新活性蛋白純化本研究小組前期研究發(fā)現(xiàn)楊樹菇 (Agrocybe aegerita) 的蛋白質(zhì)組分具有抗 腫瘤活性 , 對其中抗腫瘤活性蛋白 AAL (Agrocybe aegerita lectin,楊樹菇凝集素)進(jìn)行了分離純化 ,基因克隆,晶體結(jié)構(gòu)分析 ,發(fā)現(xiàn)抗腫瘤活性與糖結(jié)合活性相 關(guān),本論文繼續(xù)探討了 rAAL (recomb in a nt AAL，重組AAL)的抗腫瘤活性與細(xì)胞表 面相關(guān)抗原的糖基化之問的關(guān)系；并分離純化了一種新的抗腫瘤蛋白 AAD (Agrocybe aegerita Deoxyribonuc

2、lease,楊樹菇 DNase)。第一部分：rAAL 抗腫 瘤活性與細(xì)胞表面抗原糖基化的關(guān)系細(xì)胞表面糖蛋白和糖脂的糖基化改變是腫 瘤特征之一 , 這些異常的糖基化修飾能夠促進(jìn)腫瘤發(fā)生和腫瘤細(xì)胞遷移。而腫瘤中糖鏈的異化經(jīng)常是由 0-聚糖合成的不完全所導(dǎo)致，如sulfo-TF antigene (3OSO3-Gal B 1-3GalNAca -Ser/Thr)就是腫瘤相關(guān)抗原中的一種, 它在許多腫瘤中都高表達(dá) , 可以作為腫瘤治療靶標(biāo)分子。 AAL(Agrocybe aegerita lectin) 是從楊樹菇中純化的一個(gè)抗腫瘤凝集素 , 具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性。本論文用糖芯片方法(美國CFG心檢測

3、)檢測了 rAAL的糖基結(jié)合特性,結(jié)果 顯示rAAL與硫酸化糖基的親和力最高(其中與腫瘤抗原sulfo-TF二糖的親和力 排名第一 ), 其次是唾液酸化糖基。我們檢測了 AAL (?) 寸 6種腫瘤細(xì)胞系的抑制 能力，結(jié)果顯示rAAL對親和力越高的腫瘤細(xì)胞殺傷活性越強(qiáng)，通過Caspase依賴 的凋亡通路抑制腫瘤生長。用定量PCR分析腫瘤細(xì)胞中TF抗原合成途徑中相關(guān)的6種糖基轉(zhuǎn)移酶RNA表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中糖基轉(zhuǎn)移酶 GAL3ST2/ST3GAL的比值與rAAL殺傷腫瘤細(xì)胞呈正相關(guān)(R=0.7807)。通過建立過表達(dá)ST3GAL穩(wěn)定細(xì)胞系 ST3GAL1/Jurkat,降低GAL3ST2/S

4、T3GAL的比值,可以降低細(xì)胞對rAAL的親和力 和敏感性。建立過表達(dá)GAL3ST2勺穩(wěn)定細(xì)胞系GAL3ST2/HL6如GAL3ST2/HeLe細(xì)胞,增 高GAL3ST2/ST3GAL的比值,則能增強(qiáng)細(xì)胞對rAAL的親和力和敏感性。用 0-糖 鏈延伸的抑制劑Benzyl- a -GalNAc處理Jurkat細(xì)胞后,也能降低細(xì)胞對rAAL 敏感性。因此本部分研究證明AAL親和力最高的配體是腫瘤抗原一一sulfo-TF抗原, 且決定sulfo-TF 含量的糖基轉(zhuǎn)移酶GAL3ST2/ST3GAL1(?匕例與細(xì)胞對rAAL的 敏感程度呈正相關(guān),說明sulfo-TF是AAL抗腫瘤活性的重要生理靶標(biāo)之一，

5、從而 為 rAAL 進(jìn)一步用于 sulfo-TF 抗原研究和高表達(dá) sulfo-TF 抗原腫瘤的診斷、靶 向治療提供了理論依據(jù)。第二部分：一種新的楊樹菇 DNase(Agrocybe aegerita Deoxyribonuclease, AAD) 的分離、純化、性質(zhì)分析及抗腫瘤活性研究我們以前 的研究表明大型藥用真菌的蛋白質(zhì)成分有很強(qiáng)的抗腫瘤活性 , 大型藥用真菌中已 經(jīng)分離純化出多種抗腫瘤蛋白質(zhì) , 包括類泛素蛋白 (ubiquitin-like protein), 核糖體失活蛋白 (Ribosome-inactivating Proteins) 和凝集素 (lectin) 。楊樹菇 (A

6、grocybe aegerita) 子實(shí)體中蛋白質(zhì)含量約占干重的 25%-30%且, 蛋 白質(zhì)組分有很好的抗腫瘤效果 , 我們已經(jīng)從中分離純化出兩種抗腫瘤凝集素 AAL 和AAL-2。到目前為止,已有多種脫氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease, DNase) 從真菌中被分離純化 , 但沒有具有抗腫瘤活性的報(bào)道。脫氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease, DNase是一類能切割DNA雙鏈的蛋白 質(zhì), 其參與了細(xì)胞程序性死亡 , 其中 Deoxyribonuclease I (DNase I) 被作為抗腫 瘤候選藥物之一。 本部分研究中我們從楊樹菇子實(shí)體蛋白質(zhì)組分中分離純化出一 個(gè)新的抗腫瘤蛋白 AAD (Agrocybe aegerita DNase) 。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明AAD!過Caspase通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,從而抑制腫瘤細(xì)胞 生長