分光光度計(jì)的原理

1、（一）基本原理分光光度法是利用物質(zhì)對(duì)某種波長(zhǎng)的光具有選擇性吸收的特性建立起來(lái)的 鑒別物質(zhì)或測(cè)定其含量的一項(xiàng)技術(shù)。當(dāng)一束單色光通過(guò)溶液時(shí)，一部分被吸 收，一部分則透過(guò)溶液。設(shè)入射光強(qiáng)度為 10。，透射光強(qiáng)度為It,，則透光度 T=lt/Io,吸光度（A）或光密度（O. D）或稱消光度（E）則可表示為A=-lgT。根據(jù) LambertBeer 定律，吸光度與溶液的濃度成正比，與光束通過(guò)溶液的距離（即光程）成正比，用數(shù)學(xué)表達(dá)式表示為：A=KLC式中C代表該物質(zhì)的濃度，L代表光程，一般以cm表示，K為摩爾消光系 數(shù)，即當(dāng)溶液濃度為lmol/1,光程為1cm時(shí)所測(cè)得的一定波長(zhǎng)下的吸光度。由于單色光透過(guò)溶

2、液時(shí)，不僅被待測(cè)物質(zhì)所吸收，而且還被比色容器與溶 劑以及其它試劑吸收一部分，這部分需用空白管消除（空白液的做法即用與樣本相同的一切試劑，而不含被測(cè)定的物質(zhì) ）（二）波長(zhǎng)的選擇：波長(zhǎng)的選擇一般是選擇待測(cè)物質(zhì)最大吸收峰的波長(zhǎng) （?max）。因在？max測(cè)定 吸光度，敏感度最高。在吸收峰波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，波長(zhǎng)變化影響最??；而在其他波長(zhǎng)處，波長(zhǎng)變化對(duì)吸光度影響大，甚至測(cè)得濃度一吸光度曲線不呈直 線。選擇測(cè)定某一溶液所需的波長(zhǎng)，是可以用不同的波長(zhǎng)作該溶液的吸收光譜 曲線，從曲線上選擇最適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)來(lái)進(jìn)行這一溶液的測(cè)定工作，但是，在分析 工作中，尚有個(gè)別情況，不能單憑此一原則，而應(yīng)根據(jù)下列三個(gè)原則，進(jìn)行實(shí) 際

3、試測(cè)，然后全面考慮利弊，再行選定。1.應(yīng)使被測(cè)溶液有適當(dāng)?shù)墓饷芏?，一般而言，適當(dāng)?shù)墓饷芏葹?.10.7，而以 0.20.6最理想。過(guò)低的光密度因儀器的讀數(shù)誤差而產(chǎn)生很大的相對(duì)誤 差，反之，過(guò)高的光密度則往往已超過(guò)直線范圍而引入誤差。2應(yīng)使干擾影響降低至最低限度。在反應(yīng)中，如遇不易去除的干擾色澤，應(yīng)選用對(duì)此干擾色澤最不靈敏的波長(zhǎng)。3應(yīng)使標(biāo)準(zhǔn)曲線在盡可能大的范圍內(nèi)接近直線。(三)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1標(biāo)準(zhǔn)曲線的作用(1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線又叫做校正曲線或工作曲線，它是比色分析法中不可缺少的步 驟。從濃度 光密度直線的直線特性，可以判斷所采用方法的呈色反應(yīng)是否 符合 LambenBeer 氏定律。(2) 作多次平

4、行測(cè)定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可判斷在整個(gè)測(cè)定過(guò)程中操作，儀 器等誤差的大小，從而確定該測(cè)定方法的可靠性。(3) 從繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率可以比較各種方法的靈敏度。(4) 當(dāng)進(jìn)行大批樣品分析時(shí)，可省略多次計(jì)算，從光密度值直接查閱標(biāo) 準(zhǔn)曲線而求得被測(cè)物質(zhì)的濃度。2標(biāo)準(zhǔn)曲線的作法(1) 標(biāo)準(zhǔn)液濃度的選擇：在制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)液濃度選擇一般應(yīng)能包括待測(cè)樣品的可能變異最 低與最高值，一般可選擇 5 種濃度。濃度差距最好是成倍增加或等級(jí)增加，并 應(yīng)與被測(cè)液同樣條件下顯色測(cè)定。(2) 標(biāo)準(zhǔn)液的測(cè)定：在比色時(shí)，讀取光密度至少讀 23 次，求其平均值，以減少儀器不穩(wěn)定而 產(chǎn)生的誤差。(3) 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的繪制：般常用的是光

5、密度一濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線 用普通方格紙作圖。圖紙最好是正方形 （ 長(zhǎng)：寬=1:1）或長(zhǎng)方形（長(zhǎng)：寬 =3： 2），以 xx軸為濃度，縱軸為光密度，一般濃度的全距占用了多少格，光密度的全距 也應(yīng)占用相同的格數(shù)。在適當(dāng)范圍內(nèi)配制各種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，求其光密度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 以濃度位置向上延長(zhǎng)，光密度位置向右延長(zhǎng)、交點(diǎn)即為此座標(biāo)標(biāo)點(diǎn)。然后，將 各座標(biāo)點(diǎn)和原點(diǎn)聯(lián)成一條線，若符合 LambertBeer 氏定律，則系通過(guò)原點(diǎn)的直 線。 若各點(diǎn)不在一直線，則可通過(guò)原點(diǎn)，盡可能使直線通過(guò)更多點(diǎn)，使不 在直線上的點(diǎn)盡量均勻地分布在直線的兩邊。 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制完畢以后，應(yīng)在座標(biāo)紙上注明實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的名稱，所使用比 色計(jì)的型號(hào)和儀器編號(hào)、濾光片號(hào)碼或單色光波長(zhǎng)以及繪制的日期、室溫。 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：一般應(yīng)作二次或三次以上的平行測(cè)定，重復(fù)性良好曲線方可應(yīng)用。 繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線只能供以后在相