微生物降解石榴單寧為鞣花酸的研究修改

1、項(xiàng)目類別研究類別編 號(hào)資助經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目基礎(chǔ)研究山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目申請(qǐng)書（A） 學(xué)科名稱：生物技術(shù) 學(xué)科代碼：0710 項(xiàng)目名稱：微生物降解石榴單寧為鞣花酸的研究 項(xiàng)目負(fù)責(zé)人：楊露 所在學(xué)校：棗莊學(xué)院 填表日期：2015年2月10日山東省教育廳制填 表 說 明1.申請(qǐng)書為山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目的主要文件，是評(píng)審、立項(xiàng)和簽訂合同書的依據(jù)。各項(xiàng)內(nèi)容須認(rèn)真填寫，表內(nèi)欄目不能空缺，無此項(xiàng)內(nèi)容時(shí)填“/”。2.填寫申請(qǐng)書前，請(qǐng)認(rèn)真查閱山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃管理辦法。申請(qǐng)書各項(xiàng)內(nèi)容應(yīng)實(shí)事求是，表達(dá)要明確、嚴(yán)謹(jǐn)。外來語要同時(shí)用原文和中文表達(dá)，第一次出現(xiàn)的縮寫詞，須注出全稱。“項(xiàng)目名稱”（中文）要準(zhǔn)確、簡(jiǎn)

2、明、具體，字?jǐn)?shù)（含符號(hào)）不得超過30個(gè)漢字。3“學(xué)科名稱” 和“學(xué)科代碼”請(qǐng)按照學(xué)位授予與人才培養(yǎng)學(xué)科目錄（2005年12月更新版）填寫，封面上填寫該項(xiàng)目所屬的一級(jí)學(xué)科及代碼，項(xiàng)目基本信息表中填寫該項(xiàng)目所屬二級(jí)學(xué)科及代碼。4.封面右上角的“項(xiàng)目類別”和“研究類別”與項(xiàng)目基本信息表相同。5.“人才計(jì)劃”指獲得省部級(jí)以上人才計(jì)劃資助者。6.申請(qǐng)書及附件等書面材料均用A4紙雙面打印，左側(cè)裝訂，封面裝訂為紙質(zhì)。 一、項(xiàng)目基本信息項(xiàng)目概況項(xiàng)目名稱微生物降解石榴單寧為鞣花酸的研究 項(xiàng)目類別AA. 資助經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目B. 自籌經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目研究類別AA.基礎(chǔ)研究B.應(yīng)用研究申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)0.1萬元學(xué)科名稱生物技術(shù)學(xué)科代碼 0

3、71005 起止年限2015 年 3 月 至 2016年 3 月項(xiàng)目負(fù)責(zé)人姓 名楊露性 別女出生年月1993.10身份證 位學(xué)位授予時(shí)間 職稱人才計(jì)劃聯(lián)系電-mail1521929538所在科技創(chuàng)新平臺(tái)棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院所在單位學(xué)校名稱棗莊學(xué)院所在院系生命科學(xué)學(xué)院合作單位一合作單位二項(xiàng)目組情況總?cè)藬?shù)其中：教師職稱情況其中：學(xué)生情況合 作單位數(shù)高級(jí)中級(jí)初級(jí)博士生碩士生41主要參加人員姓 名職 稱身份證號(hào)工作單位項(xiàng)目分工簽 名張立華教莊學(xué)院指導(dǎo)老師楊莊

4、學(xué)院?jiǎn)螌幪崛『繙y(cè)定，微生物培養(yǎng)正交實(shí)驗(yàn)楊榮莊學(xué)院微生物培養(yǎng)正交實(shí)驗(yàn)姜?jiǎng)偾f學(xué)院?jiǎn)螌幪岷繙y(cè)定，微生物培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)主要研究?jī)?nèi)容及技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)（限200字）研究?jī)?nèi)容：篩選出能夠降解石榴皮單寧為鞣花酸的微生物2-3種，并初步探索單寧降解酶的活性，研究不同條件下微生物對(duì)石榴皮單寧的降解效果，從而得出微生物降解石榴皮單寧為鞣花酸的最優(yōu)條件。技術(shù)指標(biāo)：1、微生物對(duì)石榴皮單寧的降解率達(dá)到70%以上。2、鞣花酸產(chǎn)率達(dá)20%以上。主題詞（不超過3個(gè)）石榴皮；單寧；鞣花酸 二、立項(xiàng)依據(jù)（包括項(xiàng)目研究意義，國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢(shì)，并

5、附主要參考文獻(xiàn)）項(xiàng)目研究意義：植物單寧的利用涉及林化、制革、食品、制藥、石油等眾多行業(yè)，然而石榴作為棗莊市的特色農(nóng)產(chǎn)品，栽培面積已達(dá)到15萬畝，年產(chǎn)量13萬噸。石榴皮渣為石榴加工的副產(chǎn)物，多被廢棄，或低價(jià)銷售給一些企業(yè)進(jìn)行簡(jiǎn)單加工，利用率不高。目前研究表明石榴皮中除含有較高的單寧，本項(xiàng)目擬在得到篩選馴化得到可降解石榴皮單寧為鞣花酸的優(yōu)質(zhì)菌種，以提高石榴皮資源的利用率。國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢(shì)： 單寧(tannin)又稱為鞣質(zhì)，廣泛存在于植物的葉、殼和果實(shí)以及樹皮中，屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物。具有收斂性的澀味。BateSmith曾將單寧定義為：“單寧是分子量在5003000的能沉淀生物堿、明膠及其

6、它蛋白質(zhì)的水溶性酚類化合物。”單寧可與粘膜或唾液中的蛋白質(zhì)生成沉淀或聚合物，產(chǎn)生口腔組織粗糙褶皺的收斂或干燥的感覺，單寧還可以與多種金屬離子結(jié)合生成難溶性物質(zhì)。單寧具有很大的橫截面，易與蛋白質(zhì)發(fā)生疏水結(jié)合，同時(shí)還含有許多能轉(zhuǎn)變?yōu)轷浇Y(jié)構(gòu)的苯酚基，能與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)作用，而這些結(jié)合產(chǎn)物都會(huì)產(chǎn)生澀感。植物單寧的開發(fā)利用，涉及林化、制革、食品、制藥、石油等眾多行業(yè)。近年來，植物單寧的表面活性、與蛋白質(zhì)、生物堿和多糖的反應(yīng)、與金屬離子的絡(luò)合、對(duì)微生物和酶的抑制、抵御農(nóng)作物病蟲害。預(yù)防牲畜瘤胃臌脹病嘲、抗氧化及抗紫外等一系列重要的屬性越來越多地被認(rèn)識(shí)。目前，關(guān)于植物單寧應(yīng)用基礎(chǔ)以及開發(fā)利用的研究正日趨活

7、躍。而對(duì)于其它高附加值精細(xì)化學(xué)品的研發(fā)和應(yīng)用還不夠深入，植物單寧及其衍生物的生物活性及其利用、植物單寧精細(xì)化產(chǎn)品的開發(fā)、植物單寧的降解與利用等，正成為國(guó)內(nèi)外植物單寧研究領(lǐng)域的前沿性問題。已有的研究表明，植物單寧的利用與其分子量密切相關(guān)。分子量較大的單寧化合物收斂性強(qiáng)、顏色較深，適宜于作為制革鞣劑、粘合劑等使用；分子量較小的單寧化合物收斂性較溫和，而且顏色淺淡、滲透性好，往往表現(xiàn)出更高的化學(xué)反應(yīng)活性和生物活性。某些小分子酚類物(如桔酸、鞣花酸、花青素、兒茶素及其衍生物等)被較多地應(yīng)用于化妝品、保健品、藥物、食品等領(lǐng)域。因此，通過化學(xué)或生物降解獲取高活性小分子多酚類化合物是植物單寧精細(xì)化利用的重要

8、途徑。石榴的綜合利用研究，是目前國(guó)外學(xué)者研究的一個(gè)熱點(diǎn)。石榴皮含多種活性成分，以鞣質(zhì)、類黃酮及齊墩果酸為主，其中鞣質(zhì)含量最高，約10%15%，類黃酮的含量約為5%6%，齊墩果酸含量約為0.5%。石榴皮中提取的鞣質(zhì)成分可用于鞣制皮革，但產(chǎn)品的附加值相對(duì)較低。而鞣花酸(ellagic acid, EA)為石榴皮鞣質(zhì)成份之一，具有抵抗肺癌、食管癌、抗氧化等作用。對(duì)人體免疫缺陷病毒、鳥的成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)的逆轉(zhuǎn)錄酶和 -及 -細(xì)胞 DNA 聚合酶的抑制性。石榴皮鞣質(zhì)中游離的鞣花酸含量約為0.2%1%，其余為鞣花酸的衍生物，即鞣花單寧。有研究表明鞣花單寧在酸性條件下可被水解為鞣花酸，鞣花酸的得率可

9、達(dá)石榴皮干重的3.5%5%。鞣花酸可作為醫(yī)藥、保健品、化妝品的原料，以石榴皮為原料制取鞣花酸可以大大提高產(chǎn)品的附加值。單寧的化學(xué)或生物降解，可以獲得具有更大應(yīng)用價(jià)值的小分子活性物質(zhì)。雖然化學(xué)降解具有降解速率快的優(yōu)點(diǎn)，但降解程度不易控制，副產(chǎn)物多，產(chǎn)物的精細(xì)化利用受到限制。相反，生物降解具有條件溫和及特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，具有化學(xué)降解無可比擬的優(yōu)勢(shì)，可以獲取理想的單寧降解產(chǎn)物。單寧酶全稱單寧?；饷福且环N用途較廣泛的水解酶，在開發(fā)茶飲葉新產(chǎn)品和改善天然食品的風(fēng)味方面尤受重視。單寧酶用途廣泛，它既可以水解單寧酸的酯鍵和縮酚酸鍵產(chǎn)生沒食子酸和葡糖糖，也可以把沒食子酸和丙醇合成沒食子酸丙酯，還能水解茶葉

10、中的酯型兒茶素，制備兒茶素單體，還可以作為食品添加劑用于開發(fā)茶飲料等。主要參考文獻(xiàn)：規(guī)范格式：如：張立華,孫曉飛,張艷俠,等.石榴花化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展J.山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,40(3):33-35.微生物降解塔拉單寧為棓酸的研究分泌澀柿單寧酶的微生物篩選及其酶特性的研究黃文,石碧,李慶,等.利用多菌種共培養(yǎng)降解橡椀單寧制備鞣花酸J.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2002,01:21-24.三、研究目標(biāo)、研究?jī)?nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題研究目標(biāo)：采用梯度馴化法得到對(duì)石榴皮單寧耐受較高的優(yōu)質(zhì)菌種，研究在不同條件下微生物對(duì)石榴皮單寧降解為鞣花酸的特性，從而得到本實(shí)驗(yàn)條件下石榴皮單寧降解為鞣花酸的較優(yōu)條件。研

11、究?jī)?nèi)容：（1）石榴皮單寧降解菌的培養(yǎng)與純化野生菌種的獲得：將自然環(huán)境中的石榴皮在恒溫箱中培養(yǎng)得到野生菌種。將得到的野生菌種多次劃線培養(yǎng)直到得到純菌種。（2）石榴皮單寧降解菌的篩選與馴化將得到的微生物首先接種在含有溴酚藍(lán)的1%的石榴單寧的培養(yǎng)基上進(jìn)行菌種初篩，篩選的到的菌種接種在不同濃度的石榴單寧浸提物培養(yǎng)基中馴化，根據(jù)測(cè)量培養(yǎng)基的相關(guān)組分的變化和微生物的生長(zhǎng)情況得到對(duì)石榴單寧耐受濃度較高的優(yōu)質(zhì)菌種。（3）微生物降解石榴單寧為鞣花酸的工藝通過正交實(shí)驗(yàn)對(duì)比溫度、PH、碳源氮源補(bǔ)充等因素對(duì)石榴單寧降解和鞣花酸產(chǎn)率的影響，得到較優(yōu)條件。（4）石榴皮單寧降解酶的純化與特性分析分離純化石榴皮單寧降解酶，掌

12、握該酶的一些理化特性。擬解決的關(guān)鍵問題：（1）獲得降解石榴皮單寧能力強(qiáng)的菌種。（2）研究探索單寧降解酶的理化特性。四、研究方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)方案及可行性分析研究方法與實(shí)驗(yàn)方案： 1、單寧提取：酸提取法，有機(jī)溶劑回收。2、野生菌種的獲得：將自然環(huán)境中的石榴皮培養(yǎng)獲得的野生菌種反復(fù)劃線培養(yǎng)，直至得到純菌種。3、菌種馴化：將得到的純菌種接種在含有溴酚藍(lán)的1%的石榴單寧培養(yǎng)基上培養(yǎng)進(jìn)行菌種初篩，篩選得到的菌種接種在不同濃度的石榴單寧浸提物培養(yǎng)基中馴化，測(cè)定保溫培養(yǎng)后培養(yǎng)液中的COD值，計(jì)算COD的變化值，得出COD的變化率，以COD的去除率作為衡量單寧降解程度的指標(biāo)，對(duì)菌種進(jìn)行篩選，選取COD去除率

13、較高的菌株。4、先通過單因素試驗(yàn)確定石榴單寧濃度、氮源補(bǔ)充、培養(yǎng)溫度、PH各因素與單寧降解率鞣花酸產(chǎn)率之間的關(guān)系；再選用7因素2水平正交表，以石榴單寧、鞣花酸的含量為考察指標(biāo)，確定最優(yōu)的培養(yǎng)條件。5、培養(yǎng)基中的鞣花酸的純化：?jiǎn)螌幗到夂罄m(xù)產(chǎn)生的沉淀用熱吡啶溶解，冷卻結(jié)晶，將結(jié)晶用冷水、熱水、丙酮反復(fù)洗滌，然后真空干燥、稱重，計(jì)算產(chǎn)率。技術(shù)路線： 粗單寧提取，含量測(cè)定野生菌種培養(yǎng)，純化 單寧濃度、氮源補(bǔ)充、培養(yǎng)溫度、PH單因素實(shí)驗(yàn)1%沒食子酸培養(yǎng)基篩選耐受單寧的菌種23種四因素兩水平正交實(shí)驗(yàn)。確定各菌種降解單寧的最優(yōu)條件可行性分析：石榴皮單寧中的鞣花酸具有極強(qiáng)的抗氧化作用，具有防癌及抑制病毒的作用

14、，在制藥、生化、日化、食品以及精細(xì)化工等高科技領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，市場(chǎng)需求量大。隨當(dāng)前“追求自然”消費(fèi)觀念的興起，從石榴皮中制取的植物源的鞣花酸倍受消費(fèi)者的歡迎，也具有廣泛的利用價(jià)值，市場(chǎng)前景十分廣闊。 五、項(xiàng)目創(chuàng)新點(diǎn)本項(xiàng)目針對(duì)石榴皮利用效率低的現(xiàn)象，研究以石榴單寧為原料通過微生物降解獲得鞣花酸的方法，相對(duì)于以往的化學(xué)降解法具有降解產(chǎn)物易控制，降解過程綠色無污染等優(yōu)點(diǎn)，充分提高石榴皮的利用效率，大幅度提高產(chǎn)品附加值。六、項(xiàng)目負(fù)責(zé)人簡(jiǎn)歷與已具備的研究基礎(chǔ)、研究條件項(xiàng)目主持人楊露，棗莊學(xué)院在校本科生，實(shí)驗(yàn)操作認(rèn)真、嚴(yán)謹(jǐn)，做事負(fù)責(zé)，曾獲得棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院首屆生化技能大賽三等獎(jiǎng)。項(xiàng)目組指導(dǎo)老師

15、為棗莊市石榴工程技術(shù)研究中心研究人員，多年來一直從事石榴研究開發(fā)，在石榴研究面積累了豐富經(jīng)驗(yàn)。項(xiàng)目組成員均為棗莊學(xué)院在校本科生，曾分別獲得棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院首屆生化技能大賽一等獎(jiǎng)、三等獎(jiǎng)。品德良好、勤奮吃苦、成績(jī)優(yōu)異，對(duì)實(shí)驗(yàn)報(bào)有嚴(yán)謹(jǐn)負(fù)責(zé)的態(tài)度 七、項(xiàng)目進(jìn)度安排及提供成果形式和水平2015年03月 至05月完成預(yù)實(shí)驗(yàn)，整理分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)中存在的問題尋找更進(jìn)一步的解決方法。2015年06月至07月重復(fù)完成23次實(shí)驗(yàn)，得到更為優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，整理分析數(shù)據(jù)。2015年08月至9月完成論文。 八、經(jīng)費(fèi)概算（單位：萬元） 申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)申請(qǐng)省教育廳經(jīng)費(fèi)0.1學(xué)校配套經(jīng)費(fèi)其他自籌經(jīng)費(fèi)總經(jīng)費(fèi)支 出 科 目

16、預(yù) 算用 途1.實(shí)驗(yàn)材料費(fèi)0.1原材料及提取、分析化學(xué)試劑2.儀器設(shè)備費(fèi)/3.實(shí)驗(yàn)室改裝費(fèi)4.信息費(fèi)5.調(diào)研費(fèi)6.會(huì)議費(fèi)7.圖書資料費(fèi)8.協(xié)作費(fèi)9.成果鑒定費(fèi)10.勞務(wù)費(fèi)11.項(xiàng)目管理費(fèi)合 計(jì)其中：儀器設(shè)備材料名 稱規(guī)格型號(hào)數(shù) 量預(yù) 算/九、項(xiàng)目負(fù)責(zé)人承諾我確認(rèn)本申請(qǐng)書及附件內(nèi)容真實(shí)、準(zhǔn)確。如果獲得資助，我將嚴(yán)格按照山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃管理辦法和本申請(qǐng)書的規(guī)定，認(rèn)真履行項(xiàng)目負(fù)責(zé)人職責(zé)，積極組織開展研究工作，合理安排研究經(jīng)費(fèi)，按時(shí)報(bào)送有關(guān)材料并接受檢查。若申請(qǐng)書及附件內(nèi)容失實(shí)或在項(xiàng)目執(zhí)行過程中違反管理辦法的規(guī)定，本人將承擔(dān)全部責(zé)任。 負(fù)責(zé)人簽字： 年 月 日十、項(xiàng)目依托單位承諾已經(jīng)按照山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃管理辦法與項(xiàng)目申報(bào)要求對(duì)項(xiàng)目申請(qǐng)人的資格及項(xiàng)目申請(qǐng)書內(nèi)容進(jìn)行了審核。項(xiàng)目如獲資助，我單位將根據(jù)項(xiàng)目申請(qǐng)書內(nèi)容，落實(shí)項(xiàng)目研究所需配套經(jīng)費(fèi)及其他條件；按照山