染色體文庫(kù)的構(gòu)建及篩選

1、染色體文庫(kù)的構(gòu)建及篩選染色體文庫(kù)的構(gòu)建及篩選學(xué)號(hào)：914102380135主講人：宋玉什么是染色體文庫(kù)？什么是染色體文庫(kù)？染色體文庫(kù)及基因文庫(kù)（gene library）：是用分子克隆的方法將某種生物或其組織細(xì)胞的所有DNA片段插入適當(dāng)載體，轉(zhuǎn)化適當(dāng)宿主菌后進(jìn)行保存的克隆集合。123456目錄錄CONTENTSC C、酵母人工染色體載體、酵母人工染色體載體酵母人工染色體（Yeast artificial chromosomes 簡(jiǎn)稱(chēng)YAC），是一種能夠克隆長(zhǎng)達(dá)400Kb的DNA片段的載體，含有酵母細(xì)胞中必需的端粒、著絲點(diǎn)和復(fù)制起始序列。酵母菌的復(fù)制原點(diǎn)，端粒，著絲粒序列都已清楚，可用于完整真核

2、基因的克隆。載體載體DNA的制備的制備1、載體DNA的酶切 限制性核酸內(nèi)切酶部分消化 酶切是否完全 堿性磷酸酶去磷酸化處理后將其滅活2、載體DNA的純化 對(duì)粘粒載體：酚：氯仿混合物抽提或酒精沉淀法 對(duì)噬菌體載體：蔗糖密度梯度離心等?；蚪M基因組DNADNA克隆片段的制備克隆片段的制備一、基因組一、基因組DNADNA的提取的提取1 1、提取的、提取的DNADNA分子越長(zhǎng)，酶切后產(chǎn)生的有效末端的片段數(shù)越多鏈接反應(yīng)效率越高。分子越長(zhǎng)，酶切后產(chǎn)生的有效末端的片段數(shù)越多鏈接反應(yīng)效率越高。2 2、經(jīng)典方法：在、經(jīng)典方法：在EDTAEDTA和和SDSSDS存在條件下，用蛋白酶存在條件下，用蛋白酶K K消化細(xì)

3、胞劉姐物，然后用酚：氯消化細(xì)胞劉姐物，然后用酚：氯仿混合物抽提法除雜蛋白，再用透析法除低分子量雜質(zhì)。仿混合物抽提法除雜蛋白，再用透析法除低分子量雜質(zhì)。二、二、DNADNA克隆片段的制備克隆片段的制備1 1、關(guān)鍵：將、關(guān)鍵：將DNADNA切割成大小適中的隨機(jī)片段。切割成大小適中的隨機(jī)片段。常用方法：機(jī)械剪切法，限制性核酸內(nèi)切酶消化法。（后者更常用、高效）常用方法：機(jī)械剪切法，限制性核酸內(nèi)切酶消化法。（后者更常用、高效）2 2、采取部分消化，通過(guò)控制限制性核酸內(nèi)切酶的用量以及消化時(shí)間。、采取部分消化，通過(guò)控制限制性核酸內(nèi)切酶的用量以及消化時(shí)間。3 3、消化后分離只取長(zhǎng)度適宜的片段。（蔗糖密度梯度離

4、心法，瓊脂糖凝膠電泳）、消化后分離只取長(zhǎng)度適宜的片段。（蔗糖密度梯度離心法，瓊脂糖凝膠電泳）4 4、最好消化成、最好消化成35-45kb35-45kb的片段，并用堿性磷酸酶處理。的片段，并用堿性磷酸酶處理。重組重組DNADNA的產(chǎn)生的產(chǎn)生在正式連接反應(yīng)之前，應(yīng)通過(guò)理論實(shí)驗(yàn)確定載體、目的基因的最佳用量比。盡量使用新購(gòu)置的連接酶DNA重新純化基因組文庫(kù)的大小及代表性基因組文庫(kù)的大小及代表性N= N基因組文庫(kù)克隆總數(shù) P所需機(jī)率 f插入片段與基因組DNA長(zhǎng)度之比 ln（1-P）ln（1-f）cDNAcDNA文庫(kù)的構(gòu)建文庫(kù)的構(gòu)建以mRNA為模板，將體外反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA與適當(dāng)?shù)妮d體連接后轉(zhuǎn)化受體菌。

5、這種包括特定組織細(xì)胞所有mRNA信息的cDNA克隆的集合稱(chēng)為該組織細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。mRNAmRNA的提取的提取采取高豐度mRNA（特定mRNA達(dá)細(xì)胞總mRNA的半數(shù)以上）對(duì)mRNA進(jìn)行富集或分級(jí)分離（方法繁瑣)現(xiàn)多采用cDNA進(jìn)行富集（瓊脂糖凝膠電泳）載體一般為質(zhì)粒或視覺(jué)提載體LOREM第一鏈LOREM第二鏈LOREM末端處理cDNA克隆片段的獲得克隆片段的獲得cDNAcDNA第一鏈的合成第一鏈的合成以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄酶催化，人工合成的poly T引物從3端反轉(zhuǎn)錄。cDNA第一鏈合成效率不高，構(gòu)建一個(gè)cDNA文庫(kù)至少需要10微克mRNA。cDNAcDNA第二鏈的合成第二鏈的合成1、自

6、身引導(dǎo)合成法（經(jīng)典方法）：首先熱或堿處理將cDNA-mRNA雜合分子變性和RNA降解。然后以3發(fā)夾結(jié)構(gòu)為引物，在DNA聚合酶的作用下合成第二鏈。最后用單鏈特異的S1核酸酶消化雙鏈cDNA中對(duì)應(yīng)于mRNA5段的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。2、置換合成法（現(xiàn)在采用）：在焦磷酸鈉存在下合成cDNA第一鏈，用RNA酶H處理雜合分子，使mRNA產(chǎn)生一系列缺口，成為一系列引物，再在大腸桿菌DNA聚合酶 I的作用下合成第二鏈。該方法高效、無(wú)需純化雜合分子、不需處理發(fā)夾結(jié)構(gòu)避免cDNA損失3、PCR合成法（新策略）：在cDNA第一鏈的3端加一段oligo C尾為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得多拷貝雙鏈cDNA。這種方法不會(huì)丟失末端的

7、少數(shù)核苷酸。雙鏈雙鏈cDNAcDNA末端的處理末端的處理1、同聚物加尾法：利用小牛胸腺末端轉(zhuǎn)移酶將dNTP添加到單鏈或雙鏈DNA3羥基端的能力，將互補(bǔ)的同聚物分別加到載體與cDNA上，使二者相連。2、接頭法：將限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的接頭（）添加在末端。N = f為某一特定cDNA（mRNA）的分子數(shù)目與全部cDNA (mRNA）數(shù)目之比ln(1p)ln(1f)cDNA文庫(kù)的規(guī)模文庫(kù)的規(guī)模差減差減cDNAcDNA文庫(kù)（扣除文庫(kù)）文庫(kù)（扣除文庫(kù)）從兩種遺傳背景相同或大致相同，但個(gè)別或部分基因表達(dá)有差異的不同組織提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，在一定條件下用過(guò)量的不含目的基因的一方作為驅(qū)動(dòng)方

8、（driver），與含有目的基因的實(shí)驗(yàn)方（tester）進(jìn)行雜交選擇性去除兩部分共同基因雜交產(chǎn)生的復(fù)合物，多次重復(fù)雜交去除，將含有目的基因的未雜交部分收集，與載體連接形成cDNA文庫(kù)從基因文庫(kù)中釣取目的基因從基因文庫(kù)中釣取目的基因一、核酸雜交法1、用于核酸雜交的探針（1）、同源探針：至少含有一部分與目標(biāo)完全相同或十分相近的序列，用于基因組文庫(kù)中目的基因的釣取或cDNA文庫(kù)中篩選全長(zhǎng)的片段。部分同源探針：用于探測(cè)與其序列相關(guān)但不同的克隆，其來(lái)源包括不同種屬之間的相同基因或同屬某一基因家族的不同基因。（2）、RNA探針：來(lái)源是對(duì)克隆在載體中的核酸片段進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得。（3）、寡核苷酸探針：通過(guò)明確

9、的序列人工合成2、菌落和空斑的原位雜交二、差示雜交法對(duì)表達(dá)率較高的目的基因有效步驟：將一種可以轉(zhuǎn)錄目的基因的細(xì)胞(A)與另一種不能表達(dá)目的基因的細(xì)胞(B)分別涂布在相應(yīng)A、B培養(yǎng)皿上。A中加入血清(生長(zhǎng)因子)生長(zhǎng)一段時(shí)間后，分別從兩組細(xì)胞系中分離純化總mRNA。將A組合成cDNA并克隆，用硝酸纖維素薄膜復(fù)制兩份。同時(shí)分別用兩組的mRNA制備放射性cDNA探針，雜交處理后的薄膜，在進(jìn)行原位比較。A足cDNA雜交膜上存在B組不存在的相應(yīng)克隆必定含有目的基因。三、PCR篩選四、表達(dá)文庫(kù)的免疫學(xué)篩選對(duì)于用表達(dá)質(zhì)?；蚴删w構(gòu)建的cDNA文庫(kù)，可以用表達(dá)產(chǎn)物的特異抗體為探針進(jìn)行篩選。一、染色體步移從基因組文庫(kù)中反復(fù)篩選相互重疊的基因組片段根據(jù)已克隆的基因片段的末端序列合成探針，或是以限制性核酸內(nèi)切酶切下的末端片段為探針，反復(fù)篩選直至滿(mǎn)居需要。二、雜交捕捉和釋放用混合的cDNA與mRNA進(jìn)行雜交，將mRNA離體轉(zhuǎn)譯，當(dāng)轉(zhuǎn)譯由于雜合分子形成而被抑制時(shí)，成為雜交捕捉轉(zhuǎn)譯。通過(guò)對(duì)混合cDNA再次分組，反復(fù)雜交捕捉轉(zhuǎn)譯，鑒定出抑制某一特定蛋白轉(zhuǎn)譯的單個(gè)cDNA克隆。另一種方法為雜交后用磁珠分離等方法提取雜合分子，將其中mRNA釋放并體外轉(zhuǎn)譯從而鑒定編碼該蛋白的cDNA克隆稱(chēng)為雜交釋放轉(zhuǎn)譯其他方法其他方法mRNA的差異顯示分析限制性標(biāo)志cDNA掃描“電子”cDNA文庫(kù)篩選從非全長(zhǎng)從非全長(zhǎng)cD