免疫藥實驗方法-藥理實驗方法學-研究生

1、1影響免疫功能藥物藥理研究方法影響免疫功能藥物藥理研究方法中藥藥理教研室中藥藥理教研室 洪敏洪敏唐仲英科技樓唐仲英科技樓406 Telmail:2第一節(jié)第一節(jié) 概述概述一、免疫學研究概況一、免疫學研究概況 免疫學的免疫學的3個時期：個時期： 經(jīng)驗免疫期經(jīng)驗免疫期 科學免疫期科學免疫期 現(xiàn)代免疫期現(xiàn)代免疫期3經(jīng)驗免疫學時期經(jīng)驗免疫學時期 中國明代，正式記載接種中國明代，正式記載接種“人痘人痘”，預防天，預防天花花 1818世紀中葉，英國醫(yī)生世紀中葉，英國醫(yī)生Edward Jenner Edward Jenner 種牛種牛痘預防天花痘預防天花 目前，通過全球性大面積疫苗接

2、種我們已目前，通過全球性大面積疫苗接種我們已經(jīng)消滅了天花病毒經(jīng)消滅了天花病毒 45 科學免疫學時期科學免疫學時期 病原菌的發(fā)現(xiàn)與疫苗使用的推廣病原菌的發(fā)現(xiàn)與疫苗使用的推廣 1919世紀中葉，顯微鏡的改進使人們可在鏡下直接觀察到細菌，世紀中葉，顯微鏡的改進使人們可在鏡下直接觀察到細菌，導致病原菌的發(fā)現(xiàn)。導致病原菌的發(fā)現(xiàn)。 18501850年，首先在感染羊的血液中看到了炭疽桿菌。年，首先在感染羊的血液中看到了炭疽桿菌。 PasteurPasteur證明實驗室培養(yǎng)的炭疽桿菌能使動物感染致病，證明實驗室培養(yǎng)的炭疽桿菌能使動物感染致病，并且發(fā)明了液體培養(yǎng)基，以培養(yǎng)細菌。并且發(fā)明了液體培養(yǎng)基，以培養(yǎng)細菌。

3、 KochKoch發(fā)明固體培養(yǎng)基，分離培養(yǎng)結核桿菌成功，提出病發(fā)明固體培養(yǎng)基，分離培養(yǎng)結核桿菌成功，提出病原菌致病的概念。原菌致病的概念。Emil von Behring 1854 - 1917, Nobel Prize in 1901 for demonstrating that circulating antitoxins against diphtheria（白喉）白喉）and tetanus（破傷風）破傷風）toxins conferred immunity. Louis Pasteur 1822-1895, Father of immunology, attenuated bacte

4、ria and viruses as vaccine against anthrax（炭炭疽）疽）.Edward Jenner 1749-1822Successful vaccination against smallpox（天花）（天花）Robert Koch 1843-1910, Nobel Prize in 1905 for his work on tuberculosis（肺結核）（肺結核）, Anthrax（炭疽）（炭疽）, Cholera（霍亂）（霍亂）, Tubercule bacillus（結核桿菌）（結核桿菌）8科學免疫學時期的重要成就科學免疫學時期的重要成就u 減毒疫苗的發(fā)

5、明減毒疫苗的發(fā)明 u 抗毒素的發(fā)現(xiàn)抗毒素的發(fā)現(xiàn) u 補體的發(fā)現(xiàn)補體的發(fā)現(xiàn) u 血清學方法的建立血清學方法的建立 u 免疫化學的研究免疫化學的研究 現(xiàn)代免疫學時期現(xiàn)代免疫學時期u 免疫應答細胞和免疫應答細胞和T T細胞亞類的發(fā)現(xiàn)細胞亞類的發(fā)現(xiàn)u 免疫網(wǎng)絡學說的提出免疫網(wǎng)絡學說的提出u 抗體生成克隆選擇學說抗體生成克隆選擇學說的提出的提出u 細胞因子研究進展細胞因子研究進展u 免疫學技術的發(fā)展（免疫標記技術）免疫學技術的發(fā)展（免疫標記技術）u 免疫耐受現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)免疫耐受現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn) Clonal Selection Theory（ Burnet學說學說, 1960年諾貝爾獎年諾貝爾獎）l體內存有能識

6、別各種抗原的細胞克隆體內存有能識別各種抗原的細胞克隆(clone)(clone)，每一細胞表面，每一細胞表面均有對特定抗原的受體，能與相應抗原結合而識別它們。均有對特定抗原的受體，能與相應抗原結合而識別它們。l抗原的作用在于選擇與其相應的細胞克隆與其受體結合后，抗原的作用在于選擇與其相應的細胞克隆與其受體結合后，引起細胞的增殖分化，產生免疫應答。引起細胞的增殖分化，產生免疫應答。l 胎生期免疫細胞與自己抗原相接觸形成天然自身耐受狀態(tài)胎生期免疫細胞與自己抗原相接觸形成天然自身耐受狀態(tài)（禁忌細胞系）（禁忌細胞系）l 免疫細胞系可突變產生與自己抗原發(fā)生反應的細胞系可形免疫細胞系可突變產生與自己抗原發(fā)

7、生反應的細胞系可形成自身免疫反應成自身免疫反應 此學說對此學說對免疫學中的根本問題免疫學中的根本問題自我識別自我識別有了比較滿意有了比較滿意的解釋，對免疫學中的其他重要問題，諸如免疫記憶、免疫的解釋，對免疫學中的其他重要問題，諸如免疫記憶、免疫耐受性、自身免疫性等現(xiàn)象也能作出恰當?shù)恼f明，因此被人耐受性、自身免疫性等現(xiàn)象也能作出恰當?shù)恼f明，因此被人們廣為接受，成為們廣為接受，成為現(xiàn)代免疫學的理論基礎現(xiàn)代免疫學的理論基礎。 1112 研究進展研究進展1. 1.抗原識別受體多樣性的產生抗原識別受體多樣性的產生2. 2.信號轉導途徑的發(fā)現(xiàn)信號轉導途徑的發(fā)現(xiàn)3. 3.細胞程序性死亡途徑的發(fā)現(xiàn)細胞程序性死

8、亡途徑的發(fā)現(xiàn)4. 4.造血與免疫細胞的發(fā)育造血與免疫細胞的發(fā)育5. 5.應用免疫學的發(fā)展應用免疫學的發(fā)展 (1)DNA(1)DNA疫苗疫苗 (2)(2)基因工程制備重組細胞因子基因工程制備重組細胞因子 (3)(3)免疫細胞治療免疫細胞治療 (4)(4)完全人源抗體完全人源抗體 (5)(5)口服自身抗原口服自身抗原, ,預防自身免疫病預防自身免疫病13二、免疫功能的病理生理及免疫功能的調節(jié)二、免疫功能的病理生理及免疫功能的調節(jié) 免疫應答：免疫應答：是機體借助理化屏障及神經(jīng)體液調節(jié)控制，是機體借助理化屏障及神經(jīng)體液調節(jié)控制，通過免疫細胞及有關的體液因子（通過免疫細胞及有關的體液因子（抗體抗體or淋

9、巴因子等淋巴因子等）發(fā)揮）發(fā)揮識別自己、排除異己，以維持機體內外環(huán)境統(tǒng)一的一種功能。識別自己、排除異己，以維持機體內外環(huán)境統(tǒng)一的一種功能。 非特異性免疫應答：非特異性免疫應答：是機體防御異物進入機體以及對是機體防御異物進入機體以及對進入體內異物的清除作用，是機體與生俱來的免疫功能。進入體內異物的清除作用，是機體與生俱來的免疫功能。 特異性免疫應答：特異性免疫應答：是機體發(fā)育過程中接觸抗原后發(fā)展是機體發(fā)育過程中接觸抗原后發(fā)展而成的免疫力，包括體液免疫和細胞免疫。而成的免疫力，包括體液免疫和細胞免疫。14免疫應答的免疫應答的3個階段：個階段： （1 1）感應期感應期 抗原進入機體后，多數(shù)由單核巨抗

10、原進入機體后，多數(shù)由單核巨噬細胞攝取與加工，再將抗原信息傳遞給噬細胞攝取與加工，再將抗原信息傳遞給T T、B B淋巴淋巴細胞，使之能特異性地識別抗原。細胞，使之能特異性地識別抗原。 （2 2）增殖分化期增殖分化期 抗原激活抗原激活淋巴細胞淋巴細胞TT、B B淋巴細胞淋巴細胞致敏淋巴細胞、漿細胞。致敏淋巴細胞、漿細胞。 （3 3）效應期效應期 再次遇到抗原再次遇到抗原致敏淋巴細胞、致敏淋巴細胞、抗體抗體細胞免疫、體液免疫。細胞免疫、體液免疫。15161819免疫病理與免疫性疾病免疫病理與免疫性疾病按發(fā)病機制不同按發(fā)病機制不同, ,免疫性疾病分為：免疫性疾病分為： 超敏反應性疾病超敏反應性疾病 免

11、疫缺陷病免疫缺陷?。合忍煨约袄^發(fā)型免疫缺陷?。合忍煨约袄^發(fā)型免疫缺陷病 自身免疫病自身免疫病：類風濕性關節(jié)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡：類風濕性關節(jié)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡, ,干燥干燥 綜合征綜合征, ,多發(fā)性硬化多發(fā)性硬化 移植排斥和移植物抗宿主反應移植排斥和移植物抗宿主反應速發(fā)型：由抗體介導，速發(fā)型：由抗體介導， 發(fā)作快發(fā)作快 如：哮喘、蕁麻疹等如：哮喘、蕁麻疹等 遲發(fā)型：由細胞免疫介導，發(fā)作慢遲發(fā)型：由細胞免疫介導，發(fā)作慢 見于結核病、接觸性皮炎見于結核病、接觸性皮炎20目前臨床所用的影響免疫功能的藥物有：目前臨床所用的影響免疫功能的藥物有： 免疫增強藥：免疫增強藥：胸腺素、卡介苗、干擾素（免疫胸腺素、卡

12、介苗、干擾素（免疫調節(jié)）、左旋咪唑等。調節(jié)）、左旋咪唑等。 免疫抑制藥：免疫抑制藥：環(huán)孢素環(huán)孢素A A、他克莫司、糖皮質激、他克莫司、糖皮質激素、環(huán)磷酰胺、抗淋巴細胞球蛋白。素、環(huán)磷酰胺、抗淋巴細胞球蛋白。 中藥類：中藥類： 雙向免疫調節(jié)，如：人參、黃芪、靈芝、豬苓、雙向免疫調節(jié)，如：人參、黃芪、靈芝、豬苓、枸杞、銀耳、鹿茸、云芝等植物多糖。枸杞、銀耳、鹿茸、云芝等植物多糖。 免疫抑制，如：川烏總堿、氧化苦參堿、雷公免疫抑制，如：川烏總堿、氧化苦參堿、雷公藤多苷、生物堿等。藤多苷、生物堿等。21中國醫(yī)院用藥評價與分析,2009;9(10):726-72922三、研究的基本要求三、研究的基本要求

13、（一）動物的選擇（一）動物的選擇 由于免疫反應和基因類型有關，盡可能用由于免疫反應和基因類型有關，盡可能用純系純系動物。如純系小鼠和大鼠，并控制鼠齡、動物。如純系小鼠和大鼠，并控制鼠齡、性別和體重，以減少個體差異。若用雜種動性別和體重，以減少個體差異。若用雜種動物，最好用物，最好用同窩同窩動物。動物。23（二）（二） 動物模型動物模型 1、模型特點和要求、模型特點和要求 （1）正常正常實驗動物實驗動物 （2）免疫功能）免疫功能低下低下的動物模型的動物模型（腫瘤、衰老、腫瘤、衰老、慢性病均可造成免疫功能低下慢性病均可造成免疫功能低下） 免疫抑制劑造模（免疫抑制劑造模（如環(huán)磷酰胺、氫化可如環(huán)磷酰胺

14、、氫化可的松、環(huán)孢霉素的松、環(huán)孢霉素A A） 輻射引起免疫功能低下動物模型輻射引起免疫功能低下動物模型 24常用的免疫抑制劑常用的免疫抑制劑 1. 1. 環(huán)磷酰胺環(huán)磷酰胺：8080100mg/kg100mg/kg，ScSc，5 5天后免疫功能天后免疫功能顯著降低。顯著降低。 2. 2. 氫化可的松氫化可的松：5050100mg/kg100mg/kg，ScSc，6 68 8天后天后免疫功能顯著降低。免疫功能顯著降低。 3. 3. 抗淋巴細胞血清抗淋巴細胞血清（ALSALS）:ip 0.2ml:ip 0.2ml，5 56 6天后天后免疫功能顯著降低。免疫功能顯著降低。 4. 4. 6060CoCo

15、或或X X射線射線600600800800拉德照射拉德照射1 1次，次，4 4日后免日后免疫功能顯著降低，動物存活時間顯著縮短。疫功能顯著降低，動物存活時間顯著縮短。25（3）免疫缺陷免疫缺陷動物動物 NudeNude小鼠小鼠：該小鼠先天性無胸腺，細胞免疫力低下，失去正常T細胞功能。但其B淋巴細胞功能基本正常。BALB/cnu、NC-nu、C3H-nu、Swiss-nu ScidScid小鼠小鼠：即重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠。Scid 小鼠外觀與普通小鼠差別不大，有毛，被毛白色，體重發(fā)育正常。但胸腺、脾、淋巴結的重量不及正常的30%，組織學上表現(xiàn)為淋巴細胞顯著缺陷。 BALB/c-Scid 26（4

16、）自身免疫性疾病自身免疫性疾病模型： 類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、多發(fā)性硬化癥 （5）過敏性疾病過敏性疾病模型： 哮喘，過敏性鼻炎，接觸性皮炎等27 佐劑性關節(jié)炎模型佐劑性關節(jié)炎模型 是免疫性關節(jié)炎動物模型的基本方法。 造模多采用大鼠, 足跖部皮下注射法, 原發(fā)病變主要表現(xiàn)為致炎局部的炎癥反應, 續(xù)發(fā)病變一般于致炎后10-20天左右出現(xiàn), 20天左右達到高峰, 病理改變?yōu)榛は陆M織炎癥, 滑膜增生, 血管翳形成, 軟骨破壞, 4周后, 關節(jié)紅腫減退, 骨質減少, 新骨形成, 關節(jié)間隙變窄, 形成不可逆的關節(jié)改變。 AA大鼠的關節(jié)組織病理學及血中變化與人相似, 同時, 對其免疫學

17、機制研究發(fā)現(xiàn), 此模型存在明顯的細胞免疫異常。28 II 型膠原誘導的關節(jié)炎模型型膠原誘導的關節(jié)炎模型 II 型膠原+完全弗氏佐劑, 乳化制成乳劑, 將該乳劑于小鼠的尾根部皮內注射致炎, 腹腔注射乳劑作為激發(fā)注射。 表現(xiàn)為多發(fā)性外周關節(jié)炎, 關節(jié)局部紅腫, 嚴重致關節(jié)畸形, 病理變化為增生性滑膜炎, 關節(jié)軟骨破壞, 骨侵蝕, 關節(jié)腔內有炎性細胞浸潤, 體內可檢出針對自身型膠原的高滴度的IgG抗體, 這些臨床表現(xiàn)及實驗室指標與人密切相關。 不出現(xiàn)病情的波動和復發(fā)情況, 也沒有的皮下結節(jié), 漿膜炎, 血管炎等表現(xiàn),不出現(xiàn)類風濕因子及抗核抗體29 卵蛋白誘導的關節(jié)炎模型卵蛋白誘導的關節(jié)炎模型 卵蛋白

18、+福氏佐劑混勻, 注入動物背部皮下, 致敏, 末次注射后一周于關節(jié)內注入溶解的卵蛋白, 24小時內此關節(jié)出現(xiàn)紅腫熱痛等急性炎癥的表現(xiàn), 發(fā)病率達100%。 卵蛋白誘導的關節(jié)炎模型的病理改變有滑膜增生、血管翳形成和軟骨及骨破壞。 第一階段為關節(jié)內注入抗原后, 24小時出現(xiàn)關節(jié)腫脹, 關節(jié)直徑增加, 病理表現(xiàn)為急性滑膜炎。 第二階段為1-4周, 關節(jié)滑膜明顯增生, 血管翳形成。滑膜細胞以單核細胞、巨噬細胞為主,其次為淋巴細胞, 以CD4+淋巴細胞多見, 這一階段部分動物可出現(xiàn)早期軟骨破壞。 第三階段在4周后, 不可逆的關節(jié)軟骨及骨破壞出現(xiàn),最后可出現(xiàn)骨變形。最長的觀察到6個月, 慢性炎癥仍存在,

19、證明卵蛋白誘導的關節(jié)炎模型與在發(fā)病機理上的某些類似。302、觀察指標、觀察指標 （1）非特異性免疫非特異性免疫功能的測定指標功能的測定指標 （2）體液免疫體液免疫功能的測定指標功能的測定指標 （3）細胞免疫細胞免疫功能的測定指標功能的測定指標3、給藥途徑和劑量、給藥途徑和劑量4、對照實驗、對照實驗31（1）組間對照標準品對照組弱陽性對照組（2）自身對照（3）配對對照對照組陰性對照組空白對照組假處理對照組陽性對照組32第二節(jié)第二節(jié) 實驗方法實驗方法一、影響非特異性免疫功能實驗一、影響非特異性免疫功能實驗（一）碳粒廓清法（一）碳粒廓清法【基本原理基本原理】 網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)（網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)（RESRES

20、）是機體最主要的防御系統(tǒng)，）是機體最主要的防御系統(tǒng)，具有強大而迅速的吞噬廓清異體顆?；蚰承┛扇苄援惥哂袕姶蠖杆俚耐淌衫瀹愺w顆?；蚰承┛扇苄援愇锏哪芰?，并能迅速清除體內自身產生的某些有害物物的能力，并能迅速清除體內自身產生的某些有害物質。質。 當靜脈注入當靜脈注入特定大小特定大小的的惰性惰性顆粒后，它即可被顆粒后，它即可被RESRES細胞迅速吞噬而從血流中廓清，因此，可借助測定細胞迅速吞噬而從血流中廓清，因此，可借助測定血血流中炭粒的消失速度流中炭粒的消失速度來反映來反映RESRES吞噬異物的能力。吞噬異物的能力。33【實驗步驟實驗步驟】（1）取小鼠，隨機分組，給藥。）取小鼠，隨機分組，給藥

21、。（2）末次給藥后）末次給藥后30min，每鼠，每鼠iv印度墨汁印度墨汁0.050.1ml/10g體重。體重。（3）于）于1min（t1）和）和5min（t5）后，每鼠眼）后，每鼠眼眶靜脈眶靜脈取血取血20m ml，加到，加到2ml 0.1%NaCO3溶液溶液中搖勻。中搖勻。（4）測測OD680nm，計算廓清指數(shù)（，計算廓清指數(shù)（K）、吞）、吞噬指數(shù)。噬指數(shù)。34 廓清指數(shù)廓清指數(shù)K K 吞噬指數(shù)吞噬指數(shù) 即校正廓清指數(shù)即校正廓清指數(shù) 1551loglogttODOD4/log51ODOD脾重肝重體重3K35【注意事項注意事項】 （1 1）印度墨汁應用）印度墨汁應用NSNS稀釋稀釋1 15 5

22、倍左右，最好經(jīng)倍左右，最好經(jīng)超聲超聲處理后處理后離心離心，棄去沉淀物，以免凝集的炭粒阻塞肺毛，棄去沉淀物，以免凝集的炭粒阻塞肺毛細血管，引起動物猝死。細血管，引起動物猝死。 印度墨汁的質量可影響測定結果的準確性，墨汁印度墨汁的質量可影響測定結果的準確性，墨汁顆粒大小有嚴格要求，顆粒大小有嚴格要求，過大則不被吞噬，過小則被其過大則不被吞噬，過小則被其他吞噬細胞吞噬，他吞噬細胞吞噬，如小吞噬細胞。印度墨汁因顆粒大如小吞噬細胞。印度墨汁因顆粒大小均勻，能特異性地被單核巨噬細胞所吞噬，因而適小均勻，能特異性地被單核巨噬細胞所吞噬，因而適用于本實驗。用于本實驗。 （2 2）iv iv要熟練，要熟練，印度

23、墨汁的劑量、取血時間印度墨汁的劑量、取血時間必須準必須準確無誤。另外，取血的時間間隔也可延長至確無誤。另外，取血的時間間隔也可延長至1010分鐘。分鐘。36【評價評價】 印度墨汁法測定印度墨汁法測定RESRES吞噬活性是吞噬活性是最經(jīng)典最經(jīng)典的一種免的一種免疫學研究方法，實驗條件要求不高，方法簡便，結疫學研究方法，實驗條件要求不高，方法簡便，結果可靠，重現(xiàn)性好。果可靠，重現(xiàn)性好。 若再配合小鼠腹腔若再配合小鼠腹腔巨噬細胞吞噬消化雞紅血球巨噬細胞吞噬消化雞紅血球實實驗及驗及白細胞游走白細胞游走實驗，則可較全面地反映單核巨噬實驗，則可較全面地反映單核巨噬細胞系統(tǒng)清除異物功能狀態(tài)。細胞系統(tǒng)清除異物功

24、能狀態(tài)。37（二）小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞法（二）小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞法【基本原理基本原理】 MM具有強大的吞噬能力，雞紅細胞對鼠類是一具有強大的吞噬能力，雞紅細胞對鼠類是一種較強的抗原性異物，當其被注入小鼠腹腔后，可種較強的抗原性異物，當其被注入小鼠腹腔后，可引起腹腔引起腹腔MM聚集并吞噬，注入定量雞紅細胞聚集并吞噬，注入定量雞紅細胞（CRBCCRBC），隔一定時間后，吸取腹腔），隔一定時間后，吸取腹腔MM，鏡檢其鏡檢其吞噬活性吞噬活性，并以吞噬百分率及吞噬指數(shù)的高低表示，并以吞噬百分率及吞噬指數(shù)的高低表示MM吞噬能力的大小。吞噬能力的大小。38【實驗步驟實驗步驟】 （1）取）取

25、1822g小鼠，雌雄各半，隨機分組。小鼠，雌雄各半，隨機分組。 （2）若篩選免疫抑制藥，預先用）若篩選免疫抑制藥，預先用M誘導劑誘導劑，可在，可在實驗前實驗前34天，天，ip0.5淀粉淀粉生理鹽水溶液，每鼠生理鹽水溶液，每鼠0.5ml。 （3）4天后，天后，ip，5 CRBC 0.5ml。812h后脫后脫頸椎處死小鼠，頸椎處死小鼠，ip2ml NS，輕揉腹部，輕揉腹部1min，然后，然后吸吸出洗液出洗液1ml，分滴于兩片載玻片上，放入墊有濕紗布，分滴于兩片載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內，移置的搪瓷盒內，移置37孵箱孵箱溫育溫育30min。 （4）用）用NS漂洗，除去未粘片的細胞。晾干，漂洗

26、，除去未粘片的細胞。晾干，1 1丙酮甲醇溶液丙酮甲醇溶液固定固定5min。4（V/V）Giemsa磷磷酸緩沖液酸緩沖液染色染色3min，用流水沖洗、晾干，用流水沖洗、晾干，鏡檢鏡檢。39【結果判定結果判定】 油鏡下計每片油鏡下計每片200200個個MM，計算吞噬百分率、，計算吞噬百分率、吞噬指數(shù)。吞噬指數(shù)。吞噬百分率吞噬百分率 100100 吞噬指數(shù)吞噬指數(shù) 2 2噬的）個巨噬細胞（吞及未吞的巨噬細胞數(shù)吞噬200CRBC個巨噬細胞被吞噬的200CRBC40CRBC被消化的程度，通常分被消化的程度，通常分4級：級： 級：級：未消化。未消化。CRBCCRBC完整，胞質淺紅或淺黃帶完整，胞質淺紅或淺

27、黃帶綠色，胞核呈淺紫紅色。綠色，胞核呈淺紫紅色。 級：級：輕度消化。輕度消化。胞質淺黃綠色，胞核固縮呈紫胞質淺黃綠色，胞核固縮呈紫藍色。藍色。 級：級：重度消化。重度消化。胞質淡染，胞核呈淺灰黃色。胞質淡染，胞核呈淺灰黃色。 級：級：完全消化。完全消化。MM內僅見形態(tài)類似內僅見形態(tài)類似CRBCCRBC大小大小的空泡，邊緣整齊，胞核隱約可見。的空泡，邊緣整齊，胞核隱約可見。41【注意事項注意事項】 （1 1）實驗各步驟均需保持）實驗各步驟均需保持無菌操作無菌操作。MM誘導劑誘導劑僅用于免疫抑制藥研究。僅用于免疫抑制藥研究。 （2 2）若滴片）若滴片染色染色過深，可用過深，可用1%HCl1%HCl

28、脫色，過淺則脫色，過淺則可復染?？蓮腿?。 （3 3）每鼠）每鼠兩片的計數(shù)兩片的計數(shù)應基本一致，若差距過大，應基本一致，若差距過大，應予淘汰。腹腔吸出的液體若有血性滲出時，則應予淘汰。腹腔吸出的液體若有血性滲出時，則不宜使用。不宜使用。 42（4 4）掌握好）掌握好實驗時間實驗時間，時間太短，吞噬雞紅細胞較，時間太短，吞噬雞紅細胞較少，過長則雞紅細胞已被消化。少，過長則雞紅細胞已被消化。 （5 5）避免腹腔注射受試藥物避免腹腔注射受試藥物，以免干擾實驗結果。，以免干擾實驗結果?！驹u價評價】 本法簡便，但操作慢而欠精確，可配合其本法簡便，但操作慢而欠精確，可配合其他方法進行綜合分析。他方法進行綜合

29、分析。43（三）巨噬細胞吞噬作用的化學發(fā)光測定法（三）巨噬細胞吞噬作用的化學發(fā)光測定法【基本原理基本原理】 化學反應中電子化學反應中電子激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)產物，在其回到產物，在其回到基態(tài)基態(tài)過程過程中，以光的形式釋放能量中，以光的形式釋放能量oror將能量轉移到另一分子將能量轉移到另一分子而發(fā)射光子，利用而發(fā)射光子，利用發(fā)光檢測儀發(fā)光檢測儀測定發(fā)射光的強度測定發(fā)射光的強度oror速度，即可計算發(fā)光物質速度，即可計算發(fā)光物質oror發(fā)光物質標記的抗原發(fā)光物質標記的抗原oror抗體的含量。測定發(fā)光強度的方法，即光子計數(shù)法，抗體的含量。測定發(fā)光強度的方法，即光子計數(shù)法，可用可用液體閃爍儀液體閃爍儀進行測定

30、。進行測定。 44 M M吞噬顆粒吞噬顆粒oror受其他生物與化學因子刺激受其他生物與化學因子刺激后，細胞代謝猛增，其特征是后，細胞代謝猛增，其特征是耗氧量增加耗氧量增加，產生產生大量自由基大量自由基（氧負離子、過氧化氫、羥（氧負離子、過氧化氫、羥自由基、單線態(tài)氧），同時，往往伴有自由基、單線態(tài)氧），同時，往往伴有化學化學發(fā)光發(fā)光現(xiàn)象，但十分微弱，難以檢測。若在體現(xiàn)象，但十分微弱，難以檢測。若在體系中加入系中加入魯米諾魯米諾等等發(fā)光增強劑發(fā)光增強劑，就能增強發(fā)，就能增強發(fā)光強度，因為氧化劑激發(fā)魯米諾，可發(fā)出光強度，因為氧化劑激發(fā)魯米諾，可發(fā)出425nm425nm的光，易被檢測到。的光，易被檢測

31、到。45【操作步驟操作步驟】 （1）用）用HBSS將將M調整至調整至2106個個/ml的的細胞懸液細胞懸液備用。備用。 （2）取細胞懸液）取細胞懸液1ml，置聚乙烯小管中，加入，置聚乙烯小管中，加入10-4M魯米諾魯米諾200m ml，將小管放入液閃測量瓶中，測定發(fā)光，將小管放入液閃測量瓶中，測定發(fā)光6秒鐘，作為本底。秒鐘，作為本底。 （3）加入）加入調理調理的的酵母多糖酵母多糖200m200ml，搖勻，即刻測發(fā)，搖勻，即刻測發(fā)光光6秒鐘，以后每隔秒鐘，以后每隔35min測一次發(fā)光，直至加酵測一次發(fā)光，直至加酵母多糖母多糖1h。 （4）以發(fā)光強度（）以發(fā)光強度（cpm）為縱坐標，加酵母多糖后）

32、為縱坐標，加酵母多糖后的時間為橫坐標，繪制的時間為橫坐標，繪制M吞噬發(fā)光的動力曲線。比吞噬發(fā)光的動力曲線。比較各組的峰高、峰時（峰高的時間）、發(fā)光積分值及較各組的峰高、峰時（峰高的時間）、發(fā)光積分值及早期曲線斜率的變化。早期曲線斜率的變化。46【注意事項注意事項】 （1）注意無菌操作。所用試管、滴管、緩沖液等）注意無菌操作。所用試管、滴管、緩沖液等均需高壓滅菌，應在超凈臺內操作，避免污染。均需高壓滅菌，應在超凈臺內操作，避免污染。 （2）用臺盼藍染色，）用臺盼藍染色，M活力應在活力應在90以上。以上。 （3）所用藥物應能完全溶解，懸浮的微粒將會影）所用藥物應能完全溶解，懸浮的微粒將會影響響M的

33、反應性。的反應性。 （4）小試管與測量瓶先置暗室）小試管與測量瓶先置暗室24h，整個操作系，整個操作系統(tǒng)均在暗室進行。統(tǒng)均在暗室進行。47【方法評價方法評價】 （1）本法也可檢測）本法也可檢測M氧代謝功能與血清調氧代謝功能與血清調理作用，故作為檢測吞噬功能的指標的專一理作用，故作為檢測吞噬功能的指標的專一性不夠。性不夠。 （2）因液閃儀無溫控裝置，不能使反應系）因液閃儀無溫控裝置，不能使反應系統(tǒng)達到統(tǒng)達到37，只能通過恒定的室溫（，只能通過恒定的室溫（251）與水浴與水浴37進行間接控制。進行間接控制。48（四）溶菌酶測定法（四）溶菌酶測定法【基本原理基本原理】 溶菌酶是一種小分子蛋白質，存在

34、于機體的淚溶菌酶是一種小分子蛋白質，存在于機體的淚液、痰、鼻涕、液、痰、鼻涕、WBCWBC、血清等。測定它在體液、血清等。測定它在體液oror分分泌物中的含量及其變動情況，可作為側面了解機體泌物中的含量及其變動情況，可作為側面了解機體防御功能的一個指標。防御功能的一個指標。 體液和分泌物中的溶菌酶活性，可通過檢查其對體液和分泌物中的溶菌酶活性，可通過檢查其對指定指定敏感菌株敏感菌株的裂解作用來進行測定。的裂解作用來進行測定。492種測定法：種測定法：（1 1）光學測定法：）光學測定法：將檢品與菌液混合，用分將檢品與菌液混合，用分光光度計觀察指定時間內透光度改變的百光光度計觀察指定時間內透光度改

35、變的百分數(shù)。分數(shù)。（2 2）平板打孔測定法：）平板打孔測定法：在混有菌液的瓊脂凝在混有菌液的瓊脂凝膠上打孔，檢品放在孔內，一定時間后測膠上打孔，檢品放在孔內，一定時間后測定溶菌環(huán)直徑。定溶菌環(huán)直徑。50二、影響特異性體液免疫功能的實驗方法二、影響特異性體液免疫功能的實驗方法（一）血清溶血素測定法（一）血清溶血素測定法【基本原理基本原理】 經(jīng)經(jīng)SRBCSRBC免疫動物的淋巴細胞可產生抗免疫動物的淋巴細胞可產生抗SRBCSRBC抗體抗體（溶血素溶血素），并釋放至外周血。這種抗體在試管內），并釋放至外周血。這種抗體在試管內與與SRBCSRBC溫育，在補體（溫育，在補體（正常血清中的一組酶蛋白，正常血

36、清中的一組酶蛋白，具有溶解和殺傷細胞，增強吞噬等作用具有溶解和殺傷細胞，增強吞噬等作用）參與下可）參與下可產生溶血反應，通過測定產生溶血反應，通過測定血紅蛋白的釋放量血紅蛋白的釋放量多少來多少來間接測出血清中溶血素的含量。間接測出血清中溶血素的含量。 血紅蛋白與血紅蛋白與都氏試劑都氏試劑反應形成反應形成氰化血紅蛋白氰化血紅蛋白后比后比色測定。色測定。51【操作步驟操作步驟】 （1）免疫：免疫：小鼠，小鼠，ip 20SRBC 0.2ml/天，天，第第4天取血、分離血清，將血清稀釋后供測定天取血、分離血清，將血清稀釋后供測定（一般（一般500倍以上）。倍以上）。 （2）溶血反應：溶血反應：在試管內

37、依次加入在試管內依次加入血清血清1ml、5SRBC 0.5ml、10補體補體1ml，置，置37水浴水浴30min，然后移至冰浴中終止反應，然后移至冰浴中終止反應，1500rpm離心離心5min，取上清，取上清1ml，加都氏液，加都氏液3ml，搖勻，搖勻放置放置10min，測，測OD540nm。 52（3 3）SRBCSRBC半數(shù)溶血值半數(shù)溶血值：?。喝? 5SRBC 0.25mlSRBC 0.25ml加加都氏液都氏液4ml4ml，測，測ODOD540nm540nm。 （4 4）計算：計算：樣品管半數(shù)溶血值樣品管半數(shù)溶血值HCHC5050： 每只鼠的血清每只鼠的血清 HCHC5050 稀釋倍數(shù)稀

38、釋倍數(shù)半數(shù)溶血時的吸光度值樣品的吸光度值SRBC53【評價評價】 （1 1）簡單易行，快速，重復性好。測定）簡單易行，快速，重復性好。測定HCHC5050較準確，客觀，可克服溶血空斑法用較準確，客觀，可克服溶血空斑法用肉眼計數(shù)的錯誤。肉眼計數(shù)的錯誤。 （2 2）本實驗用）本實驗用615615純種小鼠測出的數(shù)據(jù)比較純種小鼠測出的數(shù)據(jù)比較穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。54（二）抗體形成細胞測定法（二）抗體形成細胞測定法（PFC）1 溶血空斑試驗（溶血空斑試驗（haemolytic plaque assay，HPA）【基本原理基本原理】 PFCPFC是一種體外檢測單個抗體形成細胞（漿細胞）是一種體

39、外檢測單個抗體形成細胞（漿細胞）的方法。將的方法。將SRBCSRBC免疫的小鼠脾細胞、免疫的小鼠脾細胞、SRBCSRBC、補體混、補體混合于瓊脂內，抗體形成細胞分泌的抗體在補體的參與合于瓊脂內，抗體形成細胞分泌的抗體在補體的參與下，使其周圍的下，使其周圍的SRBCSRBC的溶解形成肉眼可見的溶血空的溶解形成肉眼可見的溶血空斑，這種溶血空斑大體上可以反映抗體形成細胞數(shù)。斑，這種溶血空斑大體上可以反映抗體形成細胞數(shù)。 方法：瓊脂固相法（平皿法）：常用。方法：瓊脂固相法（平皿法）：常用。 液相單層細胞法（玻片法）：很少使用。液相單層細胞法（玻片法）：很少使用。56 直接溶血空斑試驗直接溶血空斑試驗:

40、 :測定測定產生產生 IgM IgM 型抗體的型抗體的細胞細胞。因為活化補體的能力強，只加細胞和補體即可出現(xiàn)空斑，故稱直接溶血空斑測定。 間接溶血空斑試驗間接溶血空斑試驗: : 產生其他類型抗體的產生其他類型抗體的（如（如 IgG IgG 或或 IgA IgA 等）細胞等）細胞檢測，檢測，需要加靶細胞和抗各類 Ig 的抗血清,再加補體才能出現(xiàn)可見的空斑，故稱間接溶血空斑測定。 57【操作步驟操作步驟】（1）瓊脂固相法）瓊脂固相法直接法直接法 1）免疫動物：免疫動物：選用純系小鼠，隨機分組，每鼠選用純系小鼠，隨機分組，每鼠腹腔注射腹腔注射5的的SRBC 0.2ml致敏。致敏。 2）制備補體，制備

41、補體，同前。同前。 3）制備底層瓊脂：制備底層瓊脂：稱取稱取1.4g瓊脂糖加入瓊脂糖加入100mlGeys液中，煮沸，溶化后分裝若干只預溫的液中，煮沸，溶化后分裝若干只預溫的試管，每管試管，每管5ml，置，置45恒溫水浴保溫。然后傾入恒溫水浴保溫。然后傾入水平放置的平皿（直徑水平放置的平皿（直徑9cm）中，凝固后打開平皿）中，凝固后打開平皿蓋，將平皿反扣放入蓋，將平皿反扣放入37溫箱溫箱1h，備用。，備用。584）制備脾細胞懸液：制備脾細胞懸液：免疫后第免疫后第4天，用冷天，用冷Geys制備制備107/ml脾細胞懸液，置脾細胞懸液，置4冰箱備用。冰箱備用。5）上層瓊脂的制備：上層瓊脂的制備：稱

42、取稱取0.7瓊脂糖加入瓊脂糖加入100mlGeys液中煮沸，溶化后分裝若干只預溫的液中煮沸，溶化后分裝若干只預溫的試管，每管試管，每管1.5ml，置，置45恒溫水浴保溫。逐個取恒溫水浴保溫。逐個取出，依次加入出，依次加入SRBC懸液（懸液（2109/ml）0.1ml、107/ml脾細胞懸液脾細胞懸液0.1ml，充分混勻，立即傾入上，充分混勻，立即傾入上述制備好的底層瓊脂平皿中，均勻鋪平，凝固后述制備好的底層瓊脂平皿中，均勻鋪平，凝固后靜止靜止10min。596）將平皿置）將平皿置37、5CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱培養(yǎng)培養(yǎng)2h，每皿中加入每皿中加入1 10稀釋的稀釋的豚鼠血清豚鼠血清1.0ml，均勻覆蓋

43、于表面，繼續(xù)溫育均勻覆蓋于表面，繼續(xù)溫育4050min，取出后置室溫取出后置室溫1h，4冰箱過夜，次日傾去冰箱過夜，次日傾去補體，補體，or加入加入0.25%的戊二醛（的戊二醛（NS配置），配置），使使細胞固定后計數(shù)空斑細胞固定后計數(shù)空斑。60 7）空斑計數(shù)與評定：空斑計數(shù)與評定：用放大鏡用放大鏡or雙目解剖雙目解剖鏡可見每個空斑由抗體分泌細胞及其周圍的鏡可見每個空斑由抗體分泌細胞及其周圍的透明區(qū)域組成。計數(shù)每個平皿（透明區(qū)域組成。計數(shù)每個平皿（106個細胞）個細胞）的空斑數(shù)。的空斑數(shù)。（2）瓊脂固相法）瓊脂固相法間接法：在上述間接法：在上述5）中）中再加入適當濃度的抗再加入適當濃度的抗-Ig

44、血清血清0.1ml，其他步，其他步驟相同。驟相同。61 【注意事項注意事項】（1 1）SRBCSRBC既是免疫細胞，又是靶細胞和指既是免疫細胞，又是靶細胞和指示細胞，故示細胞，故SRBCSRBC要新鮮，洗滌不得超過要新鮮，洗滌不得超過3 3次，次，每次離心每次離心5min5min。用。用AlseversAlsevers液保存的液保存的SRBCSRBC可使用可使用2 2周。周。 （2 2）為了）為了消除非特異性溶血消除非特異性溶血，豚鼠血清在使，豚鼠血清在使用前必須經(jīng)用前必須經(jīng)SRBCSRBC吸收，補體的濃度以吸收，補體的濃度以110110稀釋為宜。稀釋為宜。 62（3 3）制備脾細胞懸液：若將

45、取出的脾立即）制備脾細胞懸液：若將取出的脾立即放入放入00冰浴，可明顯降低空斑計數(shù)；在冰浴，可明顯降低空斑計數(shù)；在2020以下操作，不超過以下操作，不超過15min15min，對空斑計，對空斑計數(shù)并無影響。數(shù)并無影響。 （4 4）測定抗血清的顯斑常數(shù)（）測定抗血清的顯斑常數(shù)（K KD D）和抑）和抑斑常數(shù)（斑常數(shù)（K KI I），作為空斑計數(shù)的校正。），作為空斑計數(shù)的校正。63 （5 5）傾注底層瓊脂糖時，一定要將平皿放）傾注底層瓊脂糖時，一定要將平皿放置置水平位置水平位置，以便使底層瓊脂糖水平光滑。，以便使底層瓊脂糖水平光滑。傾上層瓊脂糖時，各種細胞成分要充分混勻。傾上層瓊脂糖時，各種細胞成

46、分要充分混勻。不能劇烈震蕩不能劇烈震蕩，以免出現(xiàn)氣泡。水浴溫度應以免出現(xiàn)氣泡。水浴溫度應控制在控制在47474949之間，溫度過高使細胞變性；之間，溫度過高使細胞變性；過低使瓊脂糖凝固，影響細胞分散。過低使瓊脂糖凝固，影響細胞分散。642 分光光度法分光光度法【基本原理基本原理】 又稱又稱SRBCSRBC的定量溶血測定法，基本原理同的定量溶血測定法，基本原理同溶血空斑法。但本法可溶血空斑法。但本法可定量測定定量測定抗體形成細抗體形成細胞所分泌的胞所分泌的抗體抗體，較溶血空斑法精確較溶血空斑法精確。同時。同時操作比較簡便。操作比較簡便。65【操作步驟操作步驟】 （1）免疫動物：同前。）免疫動物：

47、同前。 （2）制備脾細胞懸液：基本同前，制成）制備脾細胞懸液：基本同前，制成5106/ml脾細胞懸液，或按脾細胞懸液，或按15mg脾重脾重/ml制成脾細胞懸液。制成脾細胞懸液。 （3）溶血反應溶血反應：取試管若干只，每管依次加入：取試管若干只，每管依次加入脾脾細胞懸液細胞懸液、0.2SRBC、1 10豚鼠血清豚鼠血清各各0.5ml，充分混勻，另設不加補體的空白組。置充分混勻，另設不加補體的空白組。置37水浴中水浴中溫育溫育1h，離心，離心3000rpm，5min。 （4）測測OD值值：取上清測：取上清測OD413nm。66【注意事項注意事項】 （1）若使用雜種鼠時，宜將每兩只小鼠）若使用雜種鼠

48、時，宜將每兩只小鼠的脾混合液制備脾細胞懸液，可減少實驗的脾混合液制備脾細胞懸液，可減少實驗誤差。誤差。 （2）反應系統(tǒng)中其他條件不變時，）反應系統(tǒng)中其他條件不變時，SRBC濃度可根據(jù)受試藥的免疫增強濃度可根據(jù)受試藥的免疫增強or抑制作用抑制作用作適當調整。作適當調整。67三、影響特異性細胞免疫功能的實驗方法三、影響特異性細胞免疫功能的實驗方法（一）淋巴細胞轉化試驗（一）淋巴細胞轉化試驗（3H-TdR摻入法）摻入法）【基本原理基本原理】 淋巴細胞在有絲分裂原的刺激下，轉化為淋巴細胞在有絲分裂原的刺激下，轉化為母細胞，并分化增殖，細胞內蛋白質和核酸母細胞，并分化增殖，細胞內蛋白質和核酸合成增加，并

49、釋放多種淋巴因子。如在培養(yǎng)合成增加，并釋放多種淋巴因子。如在培養(yǎng)液中加入液中加入3 3H-TdRH-TdR，使其摻入到新合成的，使其摻入到新合成的DNADNA中，可以定量細胞內的中，可以定量細胞內的DNADNA合成強度。合成強度。68有絲分裂原：有絲分裂原： PHAPHA（植物血凝素）（植物血凝素） 刺激刺激T T細胞細胞 Con-ACon-A（刀豆球蛋白）（刀豆球蛋白） 刺激刺激T T細胞細胞 LPSLPS（脂多糖）（脂多糖） 刺激刺激B B細胞細胞69【操作步驟操作步驟】 （1）純系小鼠，）純系小鼠，23月齡，雌雄均可。處月齡，雌雄均可。處死小鼠，在無菌條件下迅速取出脾臟，放入死小鼠，在無

50、菌條件下迅速取出脾臟，放入盛有盛有RPMI1640培養(yǎng)液的平皿中（冰?。?，剪培養(yǎng)液的平皿中（冰?。羲?，用注射器針芯搗爛，過碎，用注射器針芯搗爛，過100目鋼篩，目鋼篩，制成制成脾細胞懸液脾細胞懸液。 （2）用培養(yǎng)液離心洗滌脾細胞）用培養(yǎng)液離心洗滌脾細胞3次，用次，用臺盼臺盼藍藍檢查活細胞數(shù)在檢查活細胞數(shù)在95以上。將細胞用培養(yǎng)以上。將細胞用培養(yǎng)液稀釋成液稀釋成2106個個/ml。 70 （3）將脾細胞加入）將脾細胞加入96孔培養(yǎng)板，每孔孔培養(yǎng)板，每孔200l，34復孔（復孔（也可更多也可更多）。）。加入有絲分裂原，加入有絲分裂原，培養(yǎng)培養(yǎng)72h。 （4）終止前）終止前6h，每孔，每孔加入加

51、入3H-TdR 1m1ml，使其，使其終濃度為終濃度為15ci/ml。 （5）用）用微量多頭微量多頭細胞收集細胞收集儀儀，將細胞抽吸在，將細胞抽吸在49型玻璃纖維濾紙上，置型玻璃纖維濾紙上，置80烘箱內干燥烘箱內干燥30min。 （6）將烘干的濾紙片放入盛有閃爍液的?。⒑娓傻臑V紙片放入盛有閃爍液的小瓶中，用瓶中，用液閃儀液閃儀測定樣品中的放射強度測定樣品中的放射強度（cpm）。）。72【注意事項注意事項】 （1 1）無菌操作。）無菌操作。 （2 2）脾細胞制備要放在冰浴中，避免細胞死）脾細胞制備要放在冰浴中，避免細胞死亡帶來誤差。亡帶來誤差。 （3 3）中藥粗制劑中影響因素較多，注意假陽）中

52、藥粗制劑中影響因素較多，注意假陽性。性?！驹u價評價】（1 1）3 3H-TdRH-TdR摻入法客觀準確。摻入法客觀準確。經(jīng)典方法。經(jīng)典方法。（2 2）可直接觀察藥物本身對淋巴細胞轉化的）可直接觀察藥物本身對淋巴細胞轉化的影響，也可觀察與有絲分裂原的協(xié)同影響，也可觀察與有絲分裂原的協(xié)同oror拮抗拮抗作用。作用。73MTT法：法：【基本原理基本原理】 MosmannMosmann等根據(jù)細胞內能量代謝水平與等根據(jù)細胞內能量代謝水平與DNADNA合成水平平行相關，首創(chuàng)了合成水平平行相關，首創(chuàng)了四甲基偶氮唑鹽四甲基偶氮唑鹽（MTTMTT）比色法。比色法。MTTMTT進入細胞后作為反應底物，進入細胞后作

53、為反應底物，被氧化成藍色的被氧化成藍色的甲臜甲臜（formazanformazan），存積于細胞內），存積于細胞內及周圍，加入及周圍，加入DMSODMSO，使細胞破裂，并使細胞內，使細胞破裂，并使細胞內甲臜釋放出來，測定甲臜釋放出來，測定ODOD490nm490nm。 74（二）二硝基氟苯誘導小鼠（二）二硝基氟苯誘導小鼠DTH反應反應【基本原理基本原理】 DNFBDNFB是一種是一種半抗原半抗原，將其溶液涂抹腹，將其溶液涂抹腹部皮膚后，與皮膚蛋白結合成部皮膚后，與皮膚蛋白結合成完全抗原完全抗原，由此刺激由此刺激T T淋巴細胞增殖成致敏淋巴細胞。淋巴細胞增殖成致敏淋巴細胞。4747天后將其再次涂

54、抹皮膚，可使局部產生天后將其再次涂抹皮膚，可使局部產生DTHDTH反應，一般在抗原攻擊反應，一般在抗原攻擊2448h2448h達高峰達高峰，故此時測定局部腫脹。故此時測定局部腫脹。75【操作步驟操作步驟】 （1 1）致敏：致敏：小鼠，隨機分組，腹部去毛，小鼠，隨機分組，腹部去毛，范圍約范圍約3 33cm3cm2 2，并將，并將1 1DNFBDNFB溶液均勻涂溶液均勻涂抹于腹部皮膚，必要時于次日再強化一次。抹于腹部皮膚，必要時于次日再強化一次。 （2 2）DTHDTH反應產生與測定：反應產生與測定：致敏后第致敏后第5 5天，天，將將1 1DNFBDNFB溶液溶液10l10l均勻涂抹于小鼠右耳均勻

55、涂抹于小鼠右耳（兩面）進行（兩面）進行攻擊攻擊，對照組同樣涂耳但未致，對照組同樣涂耳但未致敏。敏。 76 攻擊攻擊24h24h后，脫頸處死小鼠，用直徑后，脫頸處死小鼠，用直徑8mm8mm的打孔的打孔器打下圓形器打下圓形耳片耳片，稱重，以左右耳片總量之差為，稱重，以左右耳片總量之差為腫腫脹度脹度；同時取小鼠；同時取小鼠胸腺及脾臟胸腺及脾臟稱重，計算脾指數(shù)和稱重，計算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)（以每胸腺指數(shù)（以每10g10g體重計）。體重計）?！咀⒁馐马椬⒁馐马棥?（1 1）DNFBDNFB溶液要臨用前溶液要臨用前新鮮配制新鮮配制。 （2 2）在小鼠腹部應盡量去毛，且應避免剪破皮膚。）在小鼠腹部應盡量去毛，

56、且應避免剪破皮膚。 （3 3）操作者避免）操作者避免DNFBDNFB與皮膚接觸。實驗環(huán)境控與皮膚接觸。實驗環(huán)境控制在制在202022為宜。為宜。小小 結結一、影響非特異性免疫功能實驗一、影響非特異性免疫功能實驗（一）碳粒廓清法（一）碳粒廓清法/ /吞噬雞紅細胞法吞噬雞紅細胞法/ /化學發(fā)光測定法化學發(fā)光測定法( (巨噬巨噬細胞細胞) )（二）溶菌酶測定法（二）溶菌酶測定法（三）硝類蘭四氮唑（三）硝類蘭四氮唑（NBTNBT）還原試驗）還原試驗( (中性粒細胞中性粒細胞) )（四）（四）NKNK細胞活性檢測細胞活性檢測,LDH,LDH法法二、影響體液免疫功能的實驗方法二、影響體液免疫功能的實驗方法（一）血清溶血素測定法（一）血清溶血素測定法（二）抗體形成細胞測定法（二）抗體形成細胞測定法（PFCPFC）（三）抗體水平的檢測（三）抗體水平的檢測三、影響細胞免疫功能的實驗方法三、影響細胞免疫功能的實驗方法（一）淋巴細胞轉化試驗（一）淋巴細胞轉化試驗（二）（二）DTHDTH反應反應（三）細胞因子測定（三）細胞因子測定（四）細胞亞群檢測（四）細胞亞群檢測78常用免疫學技