酵母菌的培養(yǎng)與分離

1、微生物學大實驗實驗指導編者：生物技術教研室目錄實驗一酵母菌的培養(yǎng)與別離 2實驗二酵母菌的鑒定 7實驗三酵母菌耐受水平的測定 19實驗四酵母菌發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化 22實驗五耐高溫酵母菌株的誘變選育 24實驗六釀酒酵母細胞固定化與酒精發(fā)酵 27耐高溫酒精醉母菌的選育及發(fā)醉條件的研究實驗一酵母菌的培養(yǎng)與別離一、實驗目的學習培養(yǎng)和別離酵母菌的技術和方法二、根本原理大多數酵母菌為腐生,其生活最適 pH為-6,常見于含糖分較高的環(huán)境中,例如果 園土、菜地土及果皮等植物外表.酵母菌生長迅速,易于別離培養(yǎng),在液體培養(yǎng)基中, 酵母菌比霉菌生長得快.利用酵母菌喜歡酸性環(huán)境的特點,常用酸性液體培養(yǎng)基獲得酵母菌的培養(yǎng)

2、液這樣 做的好處是酸性培養(yǎng)條件那么可抑制細菌的生長,然后在固體培養(yǎng)基上用劃線法別離之. 三、實驗主要內容和要求一本次實驗的方案由同學們自己制定,實驗包括：1 .馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基,乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液的配制.2 .菌株的篩選,根據一定的生產目的并從特定的樣品篩選出高產酒精的適宜的酵母菌株.3 .酵母菌的別離,要求接種一次,28-30 C,培養(yǎng)24小時,轉接一次,28-30 C ,培養(yǎng) 24小時,并用鏡檢的方法獨立判定所別離菌株是否為酵母菌.4 .用劃線別離法對酵母菌進行純化,要求每組挑取單個菌落,連續(xù)劃線別離4代,鏡下為單一純菌株,每組擴繁10支斜面菌種,備用.四、實驗的準備1、甘蔗、成熟葡

3、萄或蘋果等果皮、喊藍染液、1ml的無菌吸管、無菌培養(yǎng)皿等.2、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：原料：馬鈴薯 200克、葡萄糖20克、瓊脂15-20克、蒸儲水 1000ml 配制方法：1先將馬鈴薯去皮,切片,稱200克并加蒸儲水1000ml,煮沸半小時,用紗布 過濾,補足蒸儲水量至1000ml ,制成20%勺馬鈴薯汁.2在20勵馬鈴薯汁中參加瓊脂,煮沸溶化,補足水分并在115c條件下高壓滅菌20分種.3參加葡萄糖,制成培養(yǎng)酵母菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基.3、乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液：配方同上,但不加瓊脂而加乳酸,按每1000ml培養(yǎng)液中含5ml乳酸的量參加,并分裝試管.五、實驗設計l、接種：取一小塊果皮,

4、不需沖洗,直接接入乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液管中,置 28-30 C,培養(yǎng)24小時,可見培養(yǎng)液變混濁.2、培養(yǎng),用無菌吸管取上述培養(yǎng)后培養(yǎng)液,注入另一管乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液 中,置28 30c再培養(yǎng)24小時或稍長過長那么霉菌長出.3、觀察：用無菌操作法取少許菌液置于載玻片中央的 峨藍染色液中,混勻后加蓋 玻片制成水浸片,先用低倍鏡后換高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)和出芽生殖情況.活酵母菌可使美藍復原,從而使菌體不著色,用此方法可判斷酵母菌的死活.4、別離：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基溶化后制成平板.用劃線法別離酵母菌培養(yǎng)液, 從而得到單個菌落.挑取單個菌落反復再次劃線別離純化,最終可獲得純培養(yǎng).六、實驗考前須

5、知1.配制培養(yǎng)基時,應注意瓊脂的加量,不同規(guī)格及批次的瓊脂的加量應由實驗確定,不能照搬書上的加量2,對培養(yǎng)基加熱時應注意瓊脂的糊底與暴沸.3.滅菌鍋操作時,首先應注意水一定要加足夠,排氣要徹底,其次滅菌期間不要離開人,滅菌結束后,關閉電源,拔掉插頭,最后放氣一定要緩慢,均勻,氣放徹底才能開鍋,取鍋內物品,應小心,預防燙傷.4,接種前應注意無菌工作臺的消毒與殺菌,接種時應注意手與接種工具的消毒.七、實驗結果的觀察及記錄小時,觀察試管內培養(yǎng)液的情況并作記錄,每組轉接 2支試管.小時,觀察試管內培養(yǎng)液的情況,鏡檢培養(yǎng)液內菌的數量,粗略判斷是否為酵母菌并作記錄,每人蘸取培養(yǎng)液進行劃線別離,并作記錄.小

6、時后,觀察培養(yǎng)皿內菌的生長的情況,挑取單個菌落進一步劃線別離,直到為純 菌落.4,每組轉接10支斜面試管,備用.八、實驗的延伸自然條件下釀造蘋果酒,葡萄酒、彳彌猴桃酒.七實驗報告要求1 .實驗完畢后,每位同學都應獨立作出實驗報告,實驗報告應類似于小型論文格式.2 .實驗報告內容包括：(1)立題意義.(2)實驗設計.(3)實驗步驟詳細記錄.(4)對實驗結果的分析討論和總結.(5)實驗延伸.(6)實驗心得體會.附1:果酒的釀制方法一、目的要求了解果酒釀制原理,學習蘋果酒釀制技術.二、根本原理果酒是一類營養(yǎng)豐富、含酒精度低的上乘飲料.它是用含一定糖分和水分的果實壓 汁,經微生物發(fā)酵而成.其生化作用,

7、除酒精發(fā)酵的主產物外,還有甘油、醋酸、琥珀 酸、雜醇油等的形成；同時,陳釀期中,各種酸類與醇類的酯化反響,賦予果酒特殊的 香味；果酒中的單寧、色素、果屑微粒及蛋白質包括酵母尸體等的氧化和下沉,使 酒液澄清、風味增濃.各種果酒以原料而稱名.除堅果外,所有栽培果,野生果均可做釀果酒的原料.本 實驗以蘋果酒為例,學習其釀制方法.三、實驗材料1 、菌種 在7° Be'麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基上的葡萄酒酵母ellipsoieleus .2、器材 蘋果汁培養(yǎng)基,7.Be'麥芽汁培養(yǎng)基,10ml/管、100ml/三角瓶等裝 量,白糖,食用酒精,亞硫酸,果膠酶,發(fā)酵缸,破碎機,果汁別離器

8、等.a.蘋果汁培養(yǎng)基粗濾新鮮果汁蔗糖調至13° Be,酸度減下1000mlK2HPO4 0.1g MgSO4 - 7H2O 0.1g配好后,加熱煮沸35分鐘,靜置10小時以上,過濾、分裝,0.7Kg/cm2滅菌 20分鐘.四、實驗步驟一酒母培養(yǎng)1 、菌種活化一級種 取裝有10ml蘋果汁或7° Be'麥芽汁培養(yǎng)基1支,按無 菌操作法接種葡萄酒酵母菌一環(huán),混勻后置 2830c下培養(yǎng)25天用蘋果汁活化菌 種時需培養(yǎng)5天以上,鏡檢酵母繁殖良好,無雜菌即可.2 、母發(fā)酵劑制備二級種在裝有100ml蘋果汁培養(yǎng)基的三角瓶中,接12ml經活化的葡萄酒酵母菌液,于 28c下培養(yǎng)23天

9、,當培養(yǎng)液外表有氣泡產生,嗅之有 酒香味、取樣鏡檢無雜菌時使用.3、生產發(fā)酵劑的制備三級種方法與母發(fā)酵劑相同,只是采取更大的容器.一般采用5001000ml的三角瓶或卡氏罐,盛裝占容積 1/23/5的果汁培養(yǎng)液,滅菌 冷卻后,按10%接種量接人母發(fā)酵劑,在2528c下培養(yǎng)2448小時,待發(fā)酵正常, 鏡檢無雜菌方可使用.4、如果使用活性干酵母,添加量為 20g/L發(fā)酵醪,復水用水量是干酵母重量的 5 10倍.復水用水的溫度應保持在 40c左右3843C,將酵母靜置510min后攪拌, 酵母在水中的時間不能超過 30min.然后使酵母溶液緩慢冷卻到與將被接種發(fā)酵醪的溫 差小于10C,然后直接參加發(fā)

10、酵醪.二果酒生產工藝流程如下：果膠酶蘋果分選除雜下清洗-破碎-壓榨-粗果汁-果楂、蘋果酸、丹寧活化酵母-母發(fā)酵劑-生產發(fā)酵劑蔗糖發(fā)酵皮渣別離后發(fā)酵原酒-換捅除渣-貯存陳釀-配制-貯存-澄清過濾-裝瓶-巴氏滅菌-封口-成品.23次 操作要點：1、分選 取成熟蘋果,除去腐爛、干疤和傷果.2、清洗 清水充分洗滌,除去果皮上的污物、雜質及藥劑,以保證原料干凈衛(wèi)生.3、破碎 為易于壓榨,提升出汁率,需進行破碎.用破碎機破碎至果塊粒度0. 5cm3 左右,并除去果籽.4、壓榨別離 破碎后立即進行壓榨別離.別離出的果汁中不得夾帶果肉,同時需添 加適量蘋果酸調整含量要求果汁總酸含量為 5g/L,并參加0.15

11、g/L的果膠酶, 促進果膠分解,使果汁澄清并提升酒的風味.由于蘋果汁易被自身含有的多酚氧化酶氧化,故需加 SO復原劑抑制酶活性,同時 SO也具有殺菌、防腐和澄清果汁作用.SO來源,除工廠應用液態(tài) SO外,實驗室常加 入亞硫酸鈉NaSO和偏重亞硫酸鉀K2S2C5,其用量為果汁量的%即可.5 、前發(fā)酵 取澄清果汁放入經干熱滅菌的發(fā)酵缸中, 裝量占缸容積的4/5,按3 5%的接種量接入酵母生產發(fā)酵劑進行發(fā)酵,保持品溫在1822 C之間,最高勿超過25 C,發(fā)酵應在712天內結束.一般蘋果汁糖分約為11%,經發(fā)酵后,酒精含量約達 6%以上,前發(fā)酵結束后,原灑灑度應大于 8% V,殘?zhí)?20g/L,總酸

12、蘋果酸 5g/Lo6 、后發(fā)酵 前發(fā)酵結束后,迅速將酒液與皮渣別離,酒汁轉入經干熱滅菌的發(fā)酵 缸中,進行后發(fā)酵,使殘?zhí)抢^續(xù)分解.期間,限制品溫在1822c之間,不要超過25C, 時間1個月,即得原酒.要求殘?zhí)呛啃∮?2g/L以下,揮發(fā)酸以醋酸計小于0.6g /L,總酸以蘋果酸計大于 5g/L07 、換桶除渣 為使已澄清的原酒與其灑腳沉淀物及時別離,以免灑腳產生異 味而影響酒質,故需進行換桶缸.換桶次數新酒每年換三次.8 、貯存陳釀 應滿桶貯存.陳釀即酒的老熟,經長期密閉貯存,可使酒質澄清、 風味醇厚.貯存室溫816C,存期半年以上.9 、配制 原酒貯存半年后可開始配制.配制時,按工藝規(guī)定將不

13、同原酒按一定配比相混,然后添加適量的糖、酒精、繼續(xù)貯存半年以上10、澄清過濾 可采用冷凍法使其澄清,即于-4 C左右存放7天,然后冷過濾.澄 清后的灑置-5-7 C下冷凍3天不發(fā)生混濁沉淀,或暴露空氣中氧化4天不變混濁即為 合格.11 、裝瓶滅菌 裝瓶后需進行巴氏滅菌,即在 63 c下處理15分鐘,冷卻后封口保 存.五、實驗報告1 、簡述蘋果酒的釀制法.2 、二氧化硫在果酒釀制中的作用是什么？六、思考題1 、酵母菌釀酒的原理是什么？2 、果酒釀制中為何要參加果膠酶？實驗二酵母菌的鑒定酒精生產中所用酵母菌在微生物學中的分類依據是什么 ？微生物學的類別分門、綱、目、科、屬、種,生產酒精用酵母菌屬于

14、微生物中的 真菌門、子囊菌綱、原子囊菌亞綱、內抱霉目、內抱霉科、啤酒酵母屬、卡爾斯伯酵 母屬等.酵母菌的分類依據是根據它的形態(tài)特征、生理生化反響特征來確定的.在分 類前將菌體細胞進行別離純化,得到由單細胞長成的菌落,然后再進行形態(tài)特征和生 理生化鑒定.一形態(tài)特征的鑒定把酵母菌接種到麥芽汁固體培養(yǎng)基上,讓它長成菌落,觀察其菌落的形態(tài)、顏 色、質地、邊緣、外表等特征.把它再接種到液體麥芽汁培養(yǎng)基中,觀察是否能產生 酸、試管或培養(yǎng)儀器外表壁上能否形成菌環(huán),培養(yǎng)液中是否產生沉淀、混濁程度等. 另外,還要取樣在顯微鏡下觀察其單細胞的形態(tài)、大小、能否形成抱子、抱子的大小 以及繁殖方式等.二生理生化特征的鑒

15、定酵母菌的生理生化特征主要表現為發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等糖類的能 力.同時,還需測定利用其它碳水化合物、同化酒精、耐酒精,利用硝酸鹽還是硫酸 鹽,發(fā)酵產酸、產醋、耐溫、耐酸、抗重金屬離子、抗雜菌性等的水平.最后,根據以上得出的形態(tài)特征和生理生化特征,查閱有關資料,把具有相同特征的 一類酵母菌,就可以歸屬于某一屬.怎樣鑒定酵母菌在液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)特征 ？將酵母菌種接種于米曲汁或麥芽汁液體培養(yǎng)基中, 放于恒溫培養(yǎng)箱內以28-30 C保 溫培養(yǎng)1824、24-48、4872小時,取出觀察各個時期液體培養(yǎng)基外表有無白色浮 膜物-醛的存在,各個不同時期培養(yǎng)基中有無沉淀或沉淀的多少、有無混濁和混

16、濁程度、 試管或其它培養(yǎng)器壁上有無菌環(huán)形成,最后取出各個不同時期的樣液,注入酵母細胞計 數器-血球計中,放置顯微鏡下觀察單個細胞的形態(tài)變化情況、液泡的大小、細胞數增 加的多少以及培養(yǎng)基中pH值的變化情況等,并測定其酒精和二氧化碳的生產量.然后 根據不同的反響情況,作好詳細的原始記錄,便于以后培養(yǎng)菌種時比擬和參考. 酵母菌生理生化試驗 一、酵母菌糖發(fā)酵試驗一實驗目的了解鑒別酵母菌的實驗方法.二實驗原理酵母菌在厭氧條件下能分解糖類,產生各種有機酸、氣體和其它產物.酵母菌種類不 同對各種糖類的發(fā)酵水平各異.因此,這是鑒別酵母菌種類的一項重要依據.酸的產生可根據培養(yǎng)基中澳甲酚紫由紫變黃或澳麝香草酚藍由

17、藍變黃指標劑顏 色的改變來確定.產氣可由發(fā)酵管氣泡的產生予以證實.三材料糖發(fā)酵根底液,%!甲酚紫或 峨麝香草酚藍溶液,葡萄糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖, 啤酒酵母斜面菌種.四實驗內容1、糖發(fā)酵根底液配制好后,按培養(yǎng)液容量的 1啕口入糖,分裝于杜氏發(fā)酵管中培養(yǎng)液 的高度約為4-5厘米,再在試管內參加倒置的小玻管約X厘米一支.每種糖設 三個重復管,121高壓滅菌15分鐘.2、將酵母分別接入上述各發(fā)酵管中,置 30C 下培養(yǎng)48-72小時,另以不接種者作對 昭 八、3、如產酸那么培養(yǎng)液pHffi下降而變黃色；如產氣,那么必先產酸,并在杜氏小管頂端出現 氣泡.4、結果記錄.以表示產酸,“ <0 &g

18、t;表示產氣,“ + 表示產酸產氣, 示無變化,“堿表示產堿.二、酵母菌碳源同化試驗(一)實驗目的了解酵母菌對各種碳源的利用情況.(二)實驗原理碳是酵母菌細胞的重要組成成分,約占酵母菌體重量的50%為酵母菌生命活動提供所需的能量和組成其結構的物質.酵母菌對各種碳源的利用,因種類不同而異.這是酵 母菌分類鑒定的一個重要依據.(三)材料無碳根底培養(yǎng)基,啤酒酵母斜面菌種, %勺葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖溶液.(四)實驗內容1、液體試管法(1)每管加無碳根底培養(yǎng)基5毫升,加被測試的某種碳源,并以葡萄糖作為對照.(2)接入啤酒酵母,<28C >下培養(yǎng)1-2周,觀察結果.2、生長圖譜法

19、(1)無碳培養(yǎng)基內參加2%勺水洗瓊脂,鬲4化后冷卻至45<-50C>,到至平板.(2)接種新鮮培養(yǎng)的啤酒酵母于1毫升無菌生理鹽水內,攪勻后倒入上述未凝平板內, 搖勻待凝.(3)皿底用特種蠟筆寫上被測試各種碳源的標記.(4)用不銹鋼匙,按標記參加相應的米粒大小的碳源,并以葡萄糖作對照.(5) <28C >下培養(yǎng)24-48小時后觀察結果.3、結果觀察(1)液體試管中是否形成酸,環(huán)島等.(2)生長圖譜中測量菌落大小,說明對碳源的利用情況.三、酵母菌氮源同化試驗(一)實驗目的了解酵母菌對各種氮源的利用情況.(二)實驗原理酵母菌蛋白酶不分泌于菌體外,故酵母菌對復雜的蛋白質不能利用

20、,酵母菌對一些較 簡單的含氮化合物的利用程度也不一致.三材料無氮根底培養(yǎng)基,啤酒酵母斜面菌, %勺蛋白陳、硫酸錢、硝酸錢和尿素溶液.四實驗內容1、液體試管法方法同二,以被測試的氮源代替碳源,不加任何氮源作空白對照.2、生長圖譜法方法同二,以被測試的氮源代替碳源,不加任何氮化物作空白對照.3、結果觀察1液體試管中溶液pH值的變化.2生長圖譜中測量形成菌落的大小,說明對各種氮源的利用情況.四、酵母菌生長曲線的測定試驗一實驗目的掌握單細胞微生物群體生長曲線的幾種測定方法.二實驗原理酵母菌屬于單細胞真核型微生物,把一定數量的酵母菌接種于的液體培養(yǎng)基中,在適 宜的溫度下培養(yǎng)時,它的生長過程具有一定的規(guī)律

21、性.在其生長過程中,定時取樣測 定酵母菌細胞數量,然后以酵母菌細胞數的對數作縱坐標,生長時間作橫坐標,繪制 所得的曲線叫生長曲線.此生長曲線大致可劃分為四個階段：調整期、對數生長期、 穩(wěn)定期和衰退期.三材料酵母菌增殖培養(yǎng)基,蘋果酒酵母斜面菌種.四實驗內容1、將培養(yǎng)24小時左右的酵母斜面菌種,用無菌水洗下菌苔,以 3000轉/分的速率離 心,得菌體.將酵母菌體沉淀物再用無菌水洗 2-3次后,制備酵母菌懸液細胞數量約 106左右/毫升,測數備用.2、取上述菌懸液1毫升于盛有清亮的酵母增殖培養(yǎng)液的試管中,<25C >下培養(yǎng),以此為起始時間,記錄起始溶液的細胞數.并在培養(yǎng) 1,2, 4,

22、6, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 20, 22, 24小時時分別取樣檢測酵母菌細胞數量.3、酵母菌細胞數量的檢測方法：活菌計數法.此法是將以上定時取出的被檢樣品作一系列稀釋后,取一定量體積在毫升之間的稀釋液涂布于盛有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內,在<25C >下培養(yǎng)24小時左右,計算培養(yǎng)皿內菌落數就可測出溶液中活菌數量.方法：血球計數板計數法.此法是先將以上定時取出的被檢樣品作一系列稀釋后,使菌落數約為105-106個/毫升,取一滴稀釋液滴于血球計數板內,在顯微鏡下直接計 算細胞總數.4、繪制生長曲線以酵母菌細胞數的對數作為縱坐標,以培養(yǎng)時間作為橫坐標,畫出酵母菌的

23、生長曲線.并分析酵母菌群體的生長規(guī)律.五、實驗結果的觀察及記錄見表12六、思考題1 .為什么碘液反映無色糖化即可結束？2 .煮沸強度對麥芽汁質量有什么影響？表1酵母菌分屬鑒定結果菌 種 號形態(tài)特征生理特征群體個體假菌 絲子囊抱子葡萄 糖發(fā) 酵類淀粉化 合物的生 成硝酸 鉀同 化肌 醇 同 化其 他巨大菌 落譏淀睦環(huán)島細胞形狀 大小無性繁殖 方式KleynGorodkow a馬鈴薯 塊石臂 塊表2酵母種的鑒定結果記錄菌形態(tài)特征生理特征糖發(fā)酹糖同化菌 落睦 膜細 胞無性假 菌子 囊葡 萄乳 糖半 乳麥 芽蜜二蔗 糖棉 子葡 萄乳 糖半乳 糖麥 芽蔗 糖纖 維蜜二海 藻L阿D阿棉 子D木可 溶山 梨

24、株形繁絲抱糖糖糖糖糖糖糖二糖糖拉拉糖糖性糖態(tài)殖子糖伯伯淀大方糖糖粉小式氮源同 化醇類同化在 無其他維生素需要硝硫乙甘山衛(wèi)赤阿肌甘維牛油抗產于耐生微微微微葉煙泛對菌酸酸醇油梨矛薛東醇路生奶脂放生37 C高物生生生生酸酸酸氨株鉀鏤醇醇醇醇醇素反分線類生長滲素素素素素鈣基培應解菌淀透BB2區(qū)Bl2苯養(yǎng)酮粉壓甲基上 生 長酸附1麥芽汁培養(yǎng)基的制備：麥芽汁制備俗稱糖化.所謂糖化是指將麥芽和輔料中高分子貯藏物質(如蛋白質、淀粉、 半纖維素等機器分解中間產物)通過麥芽中各種水解酶類(或外加酶制劑)作用降解為低 分子物質并溶于水的過程.溶解于水的各種干物質稱為浸出物,糖化后未經過濾的料液稱 為糖化醪,過濾后的

25、清夜稱為麥芽汁,麥芽汁中浸出物含量和原料干物質之比(質量分數)稱為無水浸出率.方法一(1)取50g麥芽,在EBCfe準磨上粉碎；(2)將已經粉碎好的麥芽粉放入已稱重的糖化杯中,力口 200mL4&水,不斷攪拌并在46C 水浴中保溫30min；(3)使醪液以1C/ min速率升溫到70C.此時杯內參加100mL78水,保持恒溫.(4) 5min后用玻璃棒取麥芽汁1滴,置于白滴板上,再加碘液1滴,混合后觀察碘液顏色 變化.直到碘液呈純黃色不再變色,停止保溫,糖化結束.(5)在1015min內急劇冷卻到室溫；(6)沖洗攪玻璃棒拌器,擦干糖化杯外壁,加水使其內容物準確稱量為450g；(7)用玻

26、璃棒攪拌糖化杯,并注于漏斗中進行過濾,即獲得麥芽汁.方法二 稱取市售麥芽粉或大麥經浸泡、發(fā)芽、枯燥、粉碎的麥芽粉,按每 Kg麥芽粉參加6065C 溫熱水一4kg.于5560C保溫糖化3-4小時,用碘液檢查,然后4層紗布過濾,過濾液中 加雞蛋白加水20 mL調勻之生出豐富的泡沫為止,然后倒在糖化液中攪拌煮沸后用 4層紗 布過濾,即得到澄清、透明的麥芽汁,滅菌前方可備用.附2酵母菌鑒定常用培養(yǎng)基1.酵母菌生抱培養(yǎng)基(1)麥氏瓊脂葡萄糖1gKCL1.8g酵母浸膏2.5g醋酸鈉8.2g瓊脂12g蒸儲水1000ml115 c滅菌 20min(2)胡蘿卜培養(yǎng)基將的蘿卜切成的67cm的長條,下后上薄,裝入培

27、養(yǎng)管中,加水1ml,殺菌,即成.3 Gorodkowa氏培養(yǎng)基消化蛋白1g葡萄糖0.1g氯化鈉0.5g瓊脂1.2g水100ml1.1 2.5 %豆芽汁培養(yǎng)基黃豆芽125g加1L,煮沸半小時,過濾后補足水至 1L.115c滅菌30min1.2 .6 %酵母浸汁加60g干酵母粉于1L水中,必要時參加一些蛋清以澄清濾液,121c滅菌15min,趁熱用雙 層濾紙過濾；115c滅菌15min.4 .同化碳源根底培養(yǎng)基NH%,%, %,酵母膏%,水洗瓊脂2%.115c滅菌15min同化碳源液體培養(yǎng)基NH%,KHPO,%,%.%,酵母膏,糖或其它碳源.用蒸儲水配,培養(yǎng)基過濾后分裝小試管,每管 3 ml, 1

28、15 C滅菌20min.5 .同化氮源根底培養(yǎng)基葡萄糖2%, %, %,酵母膏%,水洗瓊脂2%.用蒸儲水配,培養(yǎng)基過濾后分裝大試管,每管 20 ml, 115 C滅菌15min.附3酵母各屬檢索表一1.生子囊抱子簡稱抱子,營養(yǎng)細胞芽殖二.2 . 生子囊抱子,營養(yǎng)細胞裂殖或兼有芽殖三.3 .不生子囊抱子,但生擲抱子營養(yǎng)細胞芽殖 四4 .不生子囊抱子及擲抱子五二營養(yǎng)細胞芽殖,生子囊抱子1 .除芽生細胞外,有真菌絲1擬內抱霉屬Endomycopsis.2 .無真菌絲1營養(yǎng)細胞多邊芽殖A2營養(yǎng)細胞兩極芽殖BA 1.抱子圓卵形,光面,無凸線I2. 抱子半圓形,光面,無凸線(H)3. 抱子痣面(m)4.

29、抱子有凸線(IV)5. 抱子長條形(V)6. 生袋狀子囊,抱子多到16個,圓形(2)油脂酵母屬(Lipomyces) (1)1.抱子14個,圓,卵形,光面,無凸線；營養(yǎng)細胞多邊芽殖,圓形,卵形,長形.(3)酵母菌屬(Saccharomyces)(a)抱子生成時,子囊有二營養(yǎng)細胞結合而成.結合酵母亞屬(Zygosaccharomyces)(b)抱子生成時,子囊生試探接合枝,但無二細胞結合現象抱子圓酵母亞屬(Torulaspora ) (c)抱子生成時,子囊直接有營養(yǎng)細胞變成,無試探枝及結合現象酵母菌亞屬(Saccharomyces)2.抱子14個,光面,無凸線；圓卵形,但營養(yǎng)細胞兩極芽殖,為檸檬

30、形(4)類酵母屬(Saccharomycode9(n)抱子為半圓形或腎形1 .抱子為半圓形,多角形,或兼有圓形的(5)畢氏酵母屬( Pichia )(a)抱子生成時,子囊有二營養(yǎng)細胞結合而成.接合畢氏酵母亞屬(Zygopichia ) (b)抱子生成時,子囊有營養(yǎng)細胞直接變成畢氏酵母亞屬( Pichia )2 .抱子為腎形(a)抱子生成時,子囊有二營養(yǎng)細胞結合而成.接合腎抱酵母亞屬(Zygofabospora )(b)抱子生成時,子囊有營養(yǎng)細胞直接變成腎抱酵母亞屬(Fabospora)(m)抱子痣面1. 抱子痣面,無凸線；營養(yǎng)細胞多邊芽殖(7)彳惠巴利酵母屬(Debaryomyce92. 抱子

31、痣面,無凸線,子囊由接合子的芽子而成,營養(yǎng)細胞兩極芽殖(8)納酵母屬(Nadsonia)3. 抱子痣面,圓或卵形,中腰有凸線；營養(yǎng)細胞多邊芽殖,(9施氏酵母屬(SchwanniomyceS(IV)抱子有凸線1.抱子痣面,圓或卵形,中腰有凸線施氏酵母屬2.抱子光面,圓或卵形,中腰有凸線,使整個形體如土星狀(10)魏氏酵母屬(Williopsis )(a)抱子生成時,子囊有二營養(yǎng)細胞結合而成接合魏氏酵母亞屬(Zygowilliopsis )(b)抱子生成時,子囊直接由營養(yǎng)細胞變成魏氏酵母亞屬(Williopsis )3. 抱子光面,凸線生在一邊,使抱子形如草帽,營養(yǎng)細胞多邊芽殖(11)漢氏酵母屬(

32、Hansenula)(a)抱子生成時,子囊有二營養(yǎng)細胞結合而成接合漢氏酵母亞屬(Zygohansenula)(b)抱子生成時,子囊直接由營養(yǎng)細胞直接生成漢氏酵母亞屬(Hansenula)4.抱子光面,凸線生于一邊,使抱子形如草帽,營養(yǎng)細胞兩極芽殖,(12)抱子檸檬形酵母屬(Hanseniaspora) (V)抱子長條,梭形或鞭形.1. 一個子囊中只有一個抱子(13)單抱酵母屬(Monosporellu )2. 抱子28個,長條帶鞭毛,如鞭子(14)鞭子酉?母屬(Nematospora)3.抱子無鞭毛(15)蠅腸酵母屬( Coccidiasous )(B)營養(yǎng)細胞,兩極芽殖,檸檬形.1 .抱子生

33、成時,營養(yǎng)細胞直接變成子囊(4)類酵母屬( Saccharomycodes)2 .抱子上有凸線,使之成草帽形(12)抱子檸檬形酵母屬( Hanseniaspora )3 .抱子痣面,子囊由接合子的芽子而成(8)納酵母屬(Nadsonia)(三)營養(yǎng)細胞裂殖,或兼及芽殖,生子囊抱子.1 .由真菌絲(H)2 .假菌絲興旺(n)無真菌絲(I)(D只有裂生子,無真菌絲.1 .抱子圓形卵形16裂殖酵母屬Schizosaccharamyces2 . 抱子腎形17北港酵母屬H有真菌絲1 .有真菌絲,只裂殖生裂生子18內抱霉endomyceS2 .有真菌絲,芽殖兼及裂殖1擬內抱霉屬Endomycopsis.四

34、生擲抱子1 .擲抱子腎形,不對稱,菌落紅色或紅19擲抱酵母屬Sporobolomyces2 .擲抱子圓形或卵圓形,菌落無色或淺黃色20布爾酵母屬Bullera .五不生子囊抱子或擲抱子1 .芽殖細胞及假菌絲外生真菌絲且分裂生裂生子21芽裂酵母屬 Trichosporon 2.芽殖細胞,假菌絲及真菌絲可能有,但無裂生子I.11.普通假菌絲甚興旺,真菌絲可能有 22假絲酵母屬Candida2.無真菌絲,假菌絲原始型或無R.H 1.生類胡蘿卜素23紅酵母屬Rhodotorrula 2. 無類胡蘿卜素田.m 1.兩極芽殖,普通細胞常為檸檬形24無抱檸檬形酵母屬 Kloeckera 2 .三角芽殖,營養(yǎng)

35、細胞常為三角形25三角酵母屬 Trigonopsis 3 .營養(yǎng)細胞瓶形,芽殖,子母細胞基部甚寬,生橫膜26瓶形酵母屬 Pityrosporum 4 .營養(yǎng)細胞一端為尖穹窿狀,含糖培養(yǎng)基中生大量的酸27瓶形酵母屬 Brettanomyces 5 .營養(yǎng)細胞圓形或卵圓形IV.IV 1.生莢膜及淀粉樣物質,不發(fā)酵28隱球酵母屬Cryptococcus .2.無淀粉樣(29)圓酵母屬(Torulopsis ).酵母菌亞屬各種檢索表(1) 1.只發(fā)酵葡萄糖(包括果糖及甘露糖)及半乳糖：(a)細胞圓形,子囊抱子一個,單抱子酵母()(b)細胞圓形,子囊抱子2或多個大連酵母(c)細胞卵形球形酵母().(H)

36、 1.只發(fā)酵葡萄糖、半乳糖及蔗糖2.發(fā)酵糖類不同(田).(田)1.只發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖及棉子糖：(a)同化麥芽糖水果酵母()(b)不同化麥芽糖少抱酵母2.發(fā)酵糖類不同(IV)(IV) 1.只發(fā)酵葡萄糖、半乳糖及麥芽糖意大利酵母 (S.italicus)2.發(fā)酵糖類不同(V).(V) 1.只發(fā)酵葡萄糖、蔗糖及麥芽糖異質酵母 (S.heterogenicus)2.發(fā)酵糖類不同(VI).(VI) 1.只發(fā)酵葡萄糖、蔗糖及棉子糖舍氏酵母 (S.chevalieri)2.發(fā)酵糖類不同(叫).(vn) 1.只發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖及麥芽糖土泰因酵母 (S.Steineri)2.發(fā)酵糖類不同(Vff

37、l).(Vffl) 1.只發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖、棉子糖及蜜二糖微球酵母(S.microellipsodes)2.發(fā)酵糖類不同(IX).(K) 1.只發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖及棉子糖：(a)細胞圓形卵形酵母()(b)細胞卵到長形白氏酵母 .2.發(fā)酵糖類不同(X).(X) 1.只發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖及棉子糖：(a)細胞圓形及卵形釀酒酵母()(b)細胞長卵及長形韋爾酵母 .2.發(fā)酵糖類不同XI.知1.只發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、棉子糖及蜜二糖:a細胞圓及卵形卡爾斯伯酵母b細胞長卵形婁哥酵母c細胞長卵形及興旺的假菌絲果汁酵母2.發(fā)酵糖類不同刈.1.只發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、棉

38、子糖及蜜二糖巴氏酵母2.只發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖及棉子糖乳糖酵母實驗三酵母菌耐受水平的測定一、酵母菌耐高溫水平的測定一實驗目的了解酵母耐高溫試驗的原理及應用.學習酵母菌耐高溫試驗的操作技術.二實驗原理酵母生殖,需要一定的溫度,溫度過低或過高,均不生長,生殖率最大的溫度,稱為 最適溫度；一般的酵母,在35c以上,生殖困難,發(fā)酵力弱.三實驗材料1菌種釀酒酵母2培養(yǎng)基10Bx麥芽汁3其它 發(fā)酵瓶,吸管,接種針,培養(yǎng)箱等.四方法與步驟配制酵母培養(yǎng)液15瓶,10%的接種量接入酵母菌,加拴,抹干,稱量.按標簽各置 32 C, 35C, 38C, 40C , 42c保溫箱中.每個處理3瓶.每天稱量一

39、次,并觀察發(fā)酵情 況,5天為止.計算總減輕量,以定溫度過高之害及最高發(fā)酵溫度.五實驗結果見表3表3酵母耐高溫測定結果溫度瓶原重第1天第2天第3天第4天第4天總減輕 量最局發(fā) 酵溫度酵母32 c35 C38 C40 C42 C、酵母菌耐酒精水平的測定一實驗目的了解酵母耐酒精試驗的原理及應用.學習酵母菌耐酒精試驗的操作技術.二實驗原理酵母在糖液中發(fā)酵,到某一時刻即行停止,其最大原因之一是由于酒精濃度增高所致 每一種酵母都有其忍耐的最高酒精濃度,酵母的這個特性在應用上很重要.三實驗材料1菌種釀酒酵母2培養(yǎng)基10Bx麥芽汁3藥品95 %乙醇,4器材 無菌試管,吸管,接種針,培養(yǎng)箱等.四方法與步驟表4乙

40、醇配制濃度工程12345678910111213添加95 %乙醇量/ ml10Bx麥芽汁量/ ml培養(yǎng)基中酒精含量/%891011121314151617181920五實驗結果假設氣泡產生時間越早,產氣量越大,說明酵母的耐酒精水平越強.三、酵母菌耐酸水平的測定一實驗目的了解酵母耐酸試驗的原理及應用.學習酵母菌耐酸試驗的操作技術.二實驗原理酸對于微生物,除其氫離子的作用外,未解離的酸及酸根,都會發(fā)生影響,所以pH值相同的各種酸,與微生物有不同的作用,且酵母菌是一種生酸菌,培養(yǎng)酵母時不斷的增加 堿量,酵母也可漸漸生酸,可是于不加堿的培養(yǎng)液中,酵母生酸,達其最高度后,即不再 增加,此最高度,因菌而異

41、.三實驗材料1菌種釀酒酵母2培養(yǎng)基10Bx麥芽汁或曲汁3藥品 冰醋酸,75%的乳酸,酚酥4器材 大試管,吸管,接種環(huán),培養(yǎng)箱等.四方法與步驟(1)貼標簽于6瓶上,分別醋,醋,醋,孚L 1,乳2,乳3號.用1ml無菌吸管,移 冰醋酸于醋號瓶,于醋號瓶及于醋號瓶,移 75 %乳酸于乳1號瓶,于乳2號瓶,于乳3號 瓶中,混勻.(2)各瓶口殺菌,待冷.12支無菌大試管分6組,各組標簽記醋號,醋號,醋號,乳 1號,乳2號,乳3號.將各瓶培養(yǎng)液傾注于同號的兩管.(3)接種,25c保溫箱中培養(yǎng).(4)用滴管及液,分別滴定各瓶中所剩培養(yǎng)液的酸度,每次取 10ml滴定,反復2次 或3次,求其所用NaOH夜用的平

42、均毫升數.以a代之.以下式求培養(yǎng)液中含酸量：醋酸：a / 10 X X X 100/1000=培養(yǎng)液百毫升含醋酸克數.乳酸：a / 10 X X X 100/1000=培養(yǎng)液百毫升含乳酸克數.各瓶所含酸量,算出計入附表.(5) 3天與1周后觀察各管,看酵母是否增殖(沉渣增多)及發(fā)酵(有其生出),計入 附表.表5酵母忍耐醋酸、乳酸濃度表試管分組醋醋0.4醋乳1乳2乳3培養(yǎng)液內酸類醋酸乳酸培養(yǎng)液內酸量(g/ml )兩管重復甲乙甲乙甲乙甲乙甲乙甲乙增殖與發(fā)酵3天7天實驗四酵母菌發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化一.實驗目的掌握微生物斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基確定方法,學會對已確定菌種確定 實驗室發(fā)酵工藝.二

43、.實驗原理培養(yǎng)的目的有二：一是尋求發(fā)酵培養(yǎng)基的適宜配方,二是尋找最正確發(fā)酵條件.微生物 發(fā)酵法是一個受多種因素影響的工藝過程,應用一般的簡單比擬法很難得到滿意的結果, 實驗室中往往采用正交設計方法,對所研究的菌種進行試驗.正交試驗法是一種安排和分析試驗的方法,這種方法可以通過較少的試驗次數和比擬簡便 的分析方法,獲得較好的結果,它的特點是挑選一局部有代表性的試驗工程,利用正交表 來進行整體設計.可以同時做一批試驗,減少試驗次數,縮短試驗周期.通過分析,它能 告訴我們,哪些因素是顯著因素,哪些是非顯著因素,以及哪些因素同有交互作用和交互 作用的大小,還能分析出試驗誤差的大小.正交試驗包括兩局部內

44、容,設計試驗方案和分析試驗結果.,實驗菌種與材料:1 .菌種：酵母菌2 .發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖、蔗糖、麥芽粉3 .材料：按正交表配制培養(yǎng)基,確定發(fā)酵條件 四實驗設計：1發(fā)酵液的配制見表6,7表6正交表試驗設計因素水平糖含量接種量ml溫度C 1103162157223201028表7正交表實驗方案編號糖含量接種量溫度糖耗感官評價(A)(B)(C)1(1)(1)(1)2(1)(2)(2)3(1)(3)(3)4(2)(1)(2)5(2)(2)(3)6(2)(3)(1)7(3)(1)(3)8(3)(2)(1)9(3)(3)(2)1 .明確試驗目的,確定試驗因素,影響發(fā)酵的因素很多,考慮到實驗室條件及人力

45、和 時間,我們不能在一次試驗中包括所有因素,本實驗主要從葡萄糖、接種量、溫度三個因 素,每因素選擇三個水平,采用正交表L 9 34.2 .列出水平表,根據生產上發(fā)酵的現有了解,把葡萄糖、接種量、溫度三個因素各分 成三個水平.3 .根據因素水平表表頭設計,把正交表的數字代號依次換成該因素和水平的實際數 字.五、實驗結果的觀察與記錄試驗結果分析1 .從正交試驗結果中,我們可以得到本次實驗的直觀最正確條件,但這不一定是最正確理論 值.我們可以根據實驗的最正確條件和理論最正確條件進行比擬,在下一步試驗中可以在這些 水平范圍內,進行改變和加密水平以求得更佳條件.表中 也極差,極差大小反響了因素 變化時試

46、驗指標變化的幅度,因素的極差越大,該因素對指標的影響也會越大,也就越重 要,就更需要限制在最正確水平上.六、實驗延伸2 .要求每位同學設計四因素三水平的正交試驗3 .驗證正交試驗結果.生物量的測定方法有比濁法和直接稱重法等.由于酵母在液體深層通氣發(fā)酵過程中是 以均一混濁液的狀態(tài)存在的,所以可以采用直接比色法進行測定.測0D值：將菌懸液搖均勻后于560nm波長、1cm比色皿中測定0D值.比色測定時,用 以未接種的培養(yǎng)基作空白對照,并將 0D值填入表中,最終確定最正確培養(yǎng)基的組成及發(fā)酵時 問.七.思考題(1)比濁計數在生產實踐中有何應用價值?(2)本實驗為什么采用560nm波長測定酵母菌懸液的光密

47、度？如果你在實驗中需要測定(3)設計正交試驗的科學依據？實驗五耐高溫酵母菌株的誘變選育一.目的要求通過實驗,觀察紫外線對酵母菌的誘變效應,并學習物理因素誘變育種的方法.二.根本原理紫外線對微生物有誘變作用,主要引起是 DNA勺分子結構發(fā)生改變(同鏈 DNA勺相鄰 喀呢間形成共價結合的胸腺嚅呢二聚體),從而引起菌體遺傳性變異.測定紫外光的劑量有直接法(以爾格/平方毫米表示絕對劑量)和間接法(以輻照時間 或致死率作為相對劑量)兩種.微生物所受射線的劑量決定于燈的功率、照射距離和時間.如果功率和距離是固定的話,那么劑量就和照射的時間成正比,故照射時間的長短可作 為相對劑量.一般用15W勺紫外燈,距離

48、固定在30厘米 左右,選用致死率達90淅需的 輻射時間進行誘變處理.但各類微生物所需的最適時間不同,一般營養(yǎng)體需輻照35分鐘,芽抱要10分鐘,芽抱桿菌的營養(yǎng)體要13分鐘,革蘭氏陽性菌和無芽抱菌較易殺死, 用30 秒,放線菌的分生抱子用30秒2分鐘.輔射不宜在肉湯等成分復雜的液體中進行,以免化學反響的干擾；同時要有電磁攪 拌設備,以求照射均勻,尤其在菌液濃度較大或菌體、抱子等較大而重時很容易在處理期 間發(fā)生沉降,此時電磁攪拌更顯重要.照射前紫外燈宜先開燈預熱2030分鐘,使光波穩(wěn)定.三.菌種與儀器菌種：酵母菌儀器：血球計數板,顯微鏡,紫外線燈(15W ,電磁攪拌器,離心機 四.實驗設計(1)菌懸

49、液的制備(a)取培養(yǎng)24小時的酵母菌的斜面1支,用無菌生理鹽水將菌苔洗下,并倒入盛有玻 璃珠的大試管中,振蕩30分鐘,以打碎菌塊.(b)將上述菌液離心(1500r/min ,離心5分鐘),棄去上清液,將菌體用無菌生理鹽 水洗滌23次,最后制成菌懸液.(c)用顯微鏡直接計數法計數,調整細胞濃度為每毫升108個.(2)馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基溶化后,冷至 55c左右時倒平板,凝固后待用.(3)紫外線處理(a)將紫外線燈開關翻開預熱約20分鐘.(b)取直徑9cm無菌平皿1套,分別參加上述菌懸液6 7ml,并放入無菌大頭針于平 皿中.(c)將盛有菌懸液的1平皿置于磁力攪拌器上,在距離為 30cm,功率為15W勺紫外線 燈下分別攪拌照射 30s, 60s, 90s, 120s, 150s, 180s.(4)稀釋在紅燈下,將上述經誘變處理的菌懸液以10倍稀釋法稀釋成10-1-10-6 (具體可按估計的存活率進行稀釋).(5)涂平板取10-5、10-6、10-7三個稀釋度涂平板,每個稀釋度涂平板 3只,每只平板加 稀釋菌液0. 1ml,用無菌玻璃刮棒涂勻.以同樣操作,取未經紫外線處理的菌稀釋液涂平 板作對照.(6)培養(yǎng)將上述涂勻的平板,靜置2min后,用黑布(或黑紙)包好,置 36C、42C、50c三個 不同溫度下培養(yǎng)24小時.注意每個平皿反面