細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作

1、一：細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備 :1. 儀器 :(1) 倒置相差顯微鏡(2) CO2 培養(yǎng)箱(3) 電熱干燥箱(4) 水純化裝置(5) 冰箱:普通冰箱(培養(yǎng)液，生理鹽水，Hank'液,短期保存的組織標(biāo)本)和-20C冰箱(保持生物活性及較長(zhǎng)時(shí) 間存放的制劑如酶 ,血清等 )(6) 液氮容器 :儲(chǔ)存細(xì)胞(7) 離心機(jī) (4000rpm，1000rpm 即可及天平(8) 高壓蒸氣消毒氣(9) 濾器:Zeiss濾器，玻璃濾器，微孔濾器等。(一次性濾器：12.00X 10)(10) 消毒培養(yǎng)液，(11) 血清(12) 消化用胰酶等。2培養(yǎng)用器皿 ：(1) 培養(yǎng)瓶：250ml, 100ml (4.50

2、X 20) ,25ml (3.50 X 10)(2) 培養(yǎng)皿：10cm,9cm (3.50X 10) ,6cm (2.50X 10) ,3.5cm(3) 多孔培養(yǎng)板：96 孔(16.50X 1), 24 孔(16.50X 3), 12 孔，6 孔，4 孔(4) 玻璃瓶： 1000ml,500ml,250ml,100ml,50ml,25ml,5ml(5) 吸管：刻度吸管(吸取，轉(zhuǎn)移液體：1ml,2ml, 5ml,10ml)(3.00X 1 0)直頭吸管 (吸取，轉(zhuǎn)移 液體) 彎頭尖吸管 (吹打，混勻，傳代細(xì)胞)( 6 ) 加樣器：微量加樣器用于吸取，移動(dòng)液體，滴加樣品( 7) 其他用品：鋁飯盒，

3、橡皮吸頭，膠塞，注射器，燒杯，量筒，漏斗3器械：( 1 ) 手術(shù)刀( 2) 手術(shù)剪， 眼科剪( 18.50)( 3 ) 血管鉗 ( 4) 眼科鑷( 8.50)，小彎頭鑷( 5 ) 鐘表鑷二培養(yǎng)用品的清洗和消毒滅菌：1 各種類型毛刷 ,橡膠手套，消毒所用包裝(牛皮紙，棉布，棉線等)2 洗衣粉，洗滌劑3 5稀鹽酸 浸泡中和堿性物質(zhì)4.清潔液(次強(qiáng)液：重鉻酸鉀120g，濃硫酸200ml，蒸餾水1000ml)需陶瓷或塑料器皿 5 消毒劑： 75酒精 或 0。 1新潔爾滅消毒皮膚， 無(wú)水乙醇 (用于酒精燈)6. 抗菌素： 青霉素，鏈霉素三：培養(yǎng)用液：1 .平衡鹽溶液：D-HANKS 液(g/l )PH試

4、紙Nacl 8.00, kcl 0.40, Na2HPO4.H20 0.06, KH2PO4 0.06,NaHCO3 0.35,酚紅 0.022. 合成培養(yǎng)基： M199 培養(yǎng)基或 DMEM 培養(yǎng)基( Gibico 公司 一袋 1000ml65.00,Hepes 25g120.00)DMEM 一袋，Hepes 3.57g,NaHCO3 2.2g,三蒸水 1000ml，青霉素 100u/ml,鏈霉素 100ug/ml ph=7.27.43. FBS胎牛血清(原代培養(yǎng) 20%傳代培養(yǎng)10%) (100ml 200.00)四：組織塊的分離方法：1. 剪切分離法：組織塊在0.5mm22mm2內(nèi)，大小影

5、響不大(可調(diào)整翻瓶時(shí)間以保證組織塊貼壁)，關(guān)鍵在于組織塊邊緣整齊，光滑，要求取材迅速，動(dòng)作輕柔，剝除外膜時(shí)用力適中避免機(jī)械損傷，將鑷子夾過(guò) 處剪去，血管縱向剖開(kāi)后平鋪于平皿上，手術(shù)刀片無(wú)菌，潔凈，鋒利，垂直下刀，力求一次切斷，不要 離開(kāi)培養(yǎng)液操作，保持邊緣濕潤(rùn)。2 消化分離法：探1)胰蛋白酶法：(25g 210.00)(2)膠原酶法：五：原代培養(yǎng)方法：1. 貼塊法：在培養(yǎng)皿內(nèi)將組織塊剪成 1mm3左右的小塊，剪時(shí)可滴加 12培養(yǎng)液，以保持濕潤(rùn)。將剪切好 的小塊用吸管吸入培養(yǎng)瓶中，均勻擺置，每小塊間距0.5cm左右。輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊朝上，向瓶?jī)?nèi)注入少許培養(yǎng)液，蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶?jī)A斜放置在

6、37度培養(yǎng)箱內(nèi)。6小時(shí)后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，靜置培養(yǎng)。若組織塊不易貼壁， 可預(yù)先在瓶壁涂薄層血清，胎汁。(10%胎牛血清，10%胎兒血清，0。03% L-谷氨酰氨。110mg/l丙酮酸鈉，100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素)貼塊法具有獲得平滑肌細(xì)胞純度高，量多，操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。但用貼塊法易使平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)肌絲喪失，亞細(xì)胞器增加。2. 酶解法：組織塊剪成 12mm3,轉(zhuǎn)入新鮮配置的0。2%1型或W型膠原酶消化液中，37C恒溫?fù)u床25r/min )消化，消化液混濁，尚存有較小組織塊時(shí)，將消化液移入離心管內(nèi)，收集細(xì)胞并用培養(yǎng)液輕輕吹打混勻。細(xì)胞計(jì)數(shù)(0。1 %臺(tái)盼藍(lán))，50ml培養(yǎng)瓶接種約8

7、X 105活細(xì)胞。(沿動(dòng)脈縱軸切開(kāi)后，刮除內(nèi)皮細(xì)胞撕下中膜的內(nèi)2/3,注意不要混入內(nèi)皮細(xì)胞，將組織塊切成1-2mm2,放入加有3mg/ml膠原酶的無(wú)血清 M199培養(yǎng)基中，37C, 0.51.5h。離心去上清，重復(fù)上述消化步驟， 然后再離心(9000r,4min )，收集細(xì)胞，在 5%10%同種血清或胎牛血清的 M199培養(yǎng)基中調(diào)整細(xì)胞數(shù)， 然后轉(zhuǎn)入3090mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng))酶解離法，由于酶的作用使細(xì)胞間失去連接，細(xì)胞內(nèi)肌絲含量豐富，保持收縮型狀態(tài)。3. 貼塊+酶解法：對(duì)未消化完全的組織塊采用貼塊法接種瓶壁，先置培養(yǎng)箱2h使組織塊干固，然后補(bǔ)加 培養(yǎng)液，37 C靜置培養(yǎng)，3d后換液。4. 注意

8、： 種植組織塊的數(shù)目，如 75cm2的長(zhǎng)頸瓶組織塊不得少于30個(gè)； 根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的種屬加入適量的不同血清，一般可加入牛血清，若小牛血清增殖效果差，應(yīng)加胎牛血清(FBS),通常濃度為 10%20%六：傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)35d,需換液一次，去除飄浮的組織塊和殘留的血細(xì)胞。然后隔天換液。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)成單層，平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)峰谷樣特點(diǎn)時(shí)可傳代。消化法傳代。加入0.125%胰蛋白酶1ml，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使胰酶充分接觸細(xì)胞后去除大部分液體，鏡下觀察，35min后，細(xì)胞呈收縮狀，棄盡消化液，DMEM培養(yǎng)液洗兩遍，加10% FCS DMEM培養(yǎng)液，用彎頭吸管輕輕均勻吹打細(xì)胞，使細(xì)胞自瓶壁脫落，鏡 下觀察細(xì)胞計(jì)

9、數(shù)，按 1 : 23比例傳代。七：細(xì)胞系的維持：八：培養(yǎng)細(xì)胞的純化：九：細(xì)胞凍存與復(fù)蘇：十：培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的觀察：1. 肉眼觀察培養(yǎng)液：顏色，透明度2. 相差顯微鏡下觀察： 相差顯微鏡與倒置顯微鏡的區(qū)別光學(xué)倒置顯微鏡下觀察：原代平滑肌細(xì)胞形狀多樣，一般常為梭形、帶形、三角形或星形。貼塊法培養(yǎng)，細(xì)胞可于2周后長(zhǎng)成單層；而酶解離只需67天，鏡下可見(jiàn)明顯“峰-谷”樣生長(zhǎng)。透射電子顯微鏡下觀察：貼塊法，細(xì)胞多為合成型，肌絲減少，胞體縮小，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體、線粒體等亞細(xì)胞器逐漸增多。消化法，細(xì)胞初期表現(xiàn)為收縮型，細(xì)胞內(nèi)核位于中心，胞質(zhì)內(nèi)含豐富的肌絲及致密度體。亞細(xì)胞器少，且位于細(xì)胞邊緣

10、處，基底膜最初未見(jiàn)，后來(lái)逐漸形成。傳代后，細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)為合成型，胞體增大且變扁平，核增大，核小體數(shù)目增加，亞細(xì)胞器也增加，肌絲開(kāi)始減少，占胞內(nèi)35.4% 11.5%,甚至更少。在生化性質(zhì)方面，收縮型細(xì)胞比合成型細(xì)胞的3 -極密度脂蛋白（B -VLDL）對(duì)其受體結(jié)合能力強(qiáng)，低密度脂蛋白（LDL）分解降低，即脂質(zhì)容易在胞質(zhì)沉著。此外，像基底膜中的肝素樣物質(zhì)、膽固醇代謝等也有改變。合成型細(xì)胞內(nèi)色素 C氧化還原酶成倍增加，酸性磷酸酶亦呈34倍增加，說(shuō)明這兩類細(xì)胞不僅在形態(tài)學(xué)上，在生化、生理反應(yīng)方面也發(fā)生了較大改變。3. 細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的觀察：細(xì)胞計(jì)數(shù)：計(jì)數(shù)板4. 細(xì)胞活力的檢測(cè)方法：四唑鹽（MTT ）比色試驗(yàn)(1):0.125%胰蛋白酶消化(2):力口 10% F