瓊脂糖凝膠電泳-完整整理版

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)專題分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)專題電泳技術(shù)簡(jiǎn)介什么是電泳技術(shù)？ 電泳法，是指帶電荷的供試品（蛋白質(zhì)、核苷酸等）在惰性支持介質(zhì)（如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，于電場(chǎng)的作用下，向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng)，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測(cè)方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其百分含量的方法。電泳技術(shù)的分類電泳法可分為自由電泳（無(wú)支持體）及區(qū)帶電泳（有支持體）兩大類。自由電泳包括 Tise-leas式微量電泳、顯微電泳、等電聚焦電泳、等速電泳及密度梯度電泳。區(qū)帶電泳則包括濾紙電泳（常壓及高壓）、薄層電泳（薄膜及薄板）、醋酸纖維薄膜電泳、非凝膠性支持體區(qū)帶電泳（支

2、持體有：淀粉，纖維素粉，玻璃粉，硅膠等)、凝膠支持體區(qū)帶電泳凝膠支持體區(qū)帶電泳（瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠）等。凝膠電泳技術(shù)瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳：實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖是由瓊脂分離制備的鏈狀多糖。其結(jié)構(gòu)單元是 D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤(pán)繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。其本身不帶有電荷。因此該凝膠適合于免疫復(fù)合物、核酸與核蛋白的分離、鑒定及純化。瓊脂糖凝膠電泳：實(shí)驗(yàn)原理DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及

3、構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。DNA 分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA ，也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA 分子。瓊脂糖與瓊脂的區(qū)別瓊脂是由瓊脂糖（agarose）和瓊脂果膠（agaropectin）組成的。瓊脂糖的結(jié)構(gòu)單元是 D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖；瓊脂果膠是由許多更小的分子組成的異質(zhì)混合物。它們的結(jié)構(gòu)相似，但瓊脂果膠帶硫酸根和羧基組分，凝膠能力差。在瓊脂糖制備過(guò)程中需要把瓊脂果膠盡量去除，否則瓊脂糖有可能存在極微量硫酸根和丙酮酸取代電離基團(tuán)，就會(huì)造成電內(nèi)滲，電內(nèi)滲對(duì)質(zhì)點(diǎn)的移動(dòng)產(chǎn)生影響

4、。質(zhì)量較好的瓊脂糖硫酸根含量比較低，通常在0.2%以下，電內(nèi)滲比較小，通常在0.13%以下。簡(jiǎn)言之，瓊脂糖是從瓊脂中精細(xì)提取的，有自身獨(dú)特的性質(zhì)，所以瓊脂糖要比瓊脂貴得多。瓊脂糖凝膠電泳特點(diǎn)瓊脂糖凝膠的配置1. 根據(jù)電泳需要，配置合適濃度的電泳及制膠緩沖液。一般為 1 TAE或0.5TBE。注意：用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須是相同的。2. 根據(jù)制膠量及凝膠濃度，在加有一定量的電泳緩沖液的三角錐瓶中，加入準(zhǔn)確稱量的瓊脂糖粉。 注意：總液體量不宜超過(guò)三角錐瓶的50%容量。3. 在微波爐中加熱溶解瓊脂糖注意：必須保證瓊脂糖充分完全溶解，否則，會(huì)造成電泳圖像模糊不清。加熱時(shí)如膠液劇烈沸騰發(fā)泡

5、，停止加熱。微波爐中加熱時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。瓊脂糖凝膠的配置3. 使溶液冷卻至60左右，如需要可在此時(shí)加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5ug/ml，并充分混勻不提倡使用。注意：溴化乙錠是一種致癌物質(zhì)。使用含有溴化乙錠的溶液時(shí)，請(qǐng)戴用手套。溴化乙錠在可見(jiàn)光下會(huì)分解。5. 將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當(dāng)位置處插上梳子。凝膠厚度一般在35 mm 之間。 注意：不要產(chǎn)生氣泡，溶液溫度太高(60)，會(huì)使得水分過(guò)分蒸發(fā)，改變凝膠離子濃度，影響電泳效果。6. 在室溫下使膠凝固（大約30 分鐘），然后放置于電泳槽中進(jìn)行電泳。注意： 凝膠不立即使用時(shí)，用保鮮膜將凝膠包好在4下保存，或者放在制膠的緩沖液中

6、，一般可保存25 天。瓊脂糖凝膠緩沖液有幾種緩沖液適用于天然雙鏈DNA的電泳Tris-乙酸鹽和EDTA緩沖液（pH8.0,TAE，也稱為E緩沖液）Tris-硼酸鹽緩沖液(TBE)Tris-磷酸鹽緩沖液(TPE)瓊脂糖凝膠緩沖液瓊脂糖凝膠緩沖液瓊脂糖凝膠緩沖液TBE可以使用10次左右，而TAE用23次就要更換。電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA條帶模糊或不規(guī)則DNA帶遷移。電泳緩沖液剛好沒(méi)過(guò)凝膠1mm為好，太多則電流加大，凝膠發(fā)熱。瓊脂糖凝膠載樣緩沖液載樣緩沖液是上樣時(shí)與樣品一起加入泳道的。載樣緩沖液有三個(gè)作用：增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內(nèi)；使樣品

7、帶有顏色便于上樣操作；其中的染料在電場(chǎng)中以可以預(yù)測(cè)的泳動(dòng)速率向陽(yáng)極遷移。上樣緩沖液有幾種，但基本都包括溴酚藍(lán)和二甲苯氰FF。瓊脂糖凝膠載樣緩沖液溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠中遷移速率是二甲苯氰FF的2.2倍，這一特性與瓊脂糖凝膠的濃度無(wú)關(guān)；在0.5TBE瓊脂糖凝膠電泳中溴酚藍(lán)的速率約與長(zhǎng)約300bp的線性雙鏈DNA相同，而二甲苯氰FF約與長(zhǎng)4kb的DNA相同。在0.5%-1.4%濃度的瓊脂糖凝膠中基本不會(huì)變化。瓊脂糖凝膠載樣緩沖液影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的

8、構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7DNA分子大小遷移速率U與logN成反比（N為堿基對(duì)數(shù)目）。分子越大，摩擦阻力越大，同時(shí)大分子通過(guò)凝膠孔徑的效率也低于較小的分子，所以分子大的遷移慢。等量的空間結(jié)構(gòu)，緊密的電泳快（超螺旋線性DNA）一般來(lái)說(shuō)，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7簡(jiǎn)言之，濃度越大，分子孔徑就越小，DNA遷移速率就越低，反之遷移速率就大。另外，濃度也跟凝膠的分辨率有關(guān)，濃度越大，分辨率越高，但分離的片段就越小

9、。瓊脂糖凝膠的濃度影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7一般遷移速率超螺旋環(huán)狀線狀DNA單鏈開(kāi)環(huán)。影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7 低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過(guò)5-8V/cm影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7 包括標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖以及正在研制的介于二者之間的瓊脂糖。其分辨率等各有不

10、同。瓊脂糖凝膠的濃度影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7溶液pH值距離其等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大，尤其對(duì)于蛋白質(zhì)等兩性分子，緩沖液pH還會(huì)影響到其電泳方向;溶液的離子強(qiáng)度過(guò)低，會(huì)使電導(dǎo)率降低，DNA不是全然不動(dòng)就是遷移極慢；而離子過(guò)強(qiáng)時(shí)，電導(dǎo)率上升，會(huì)產(chǎn)生大量熱能，使凝膠變化甚至熔化，也會(huì)使DNA變性。影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7染色劑溴化乙錠插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長(zhǎng)度增加，因此，

11、線性DNA-染料復(fù)合物在凝膠中的遷移率約降低15%。DNADNA電泳常見(jiàn)問(wèn)題分析電泳常見(jiàn)問(wèn)題分析問(wèn)題問(wèn)題原因原因解決辦法解決辦法DNADNA帶模糊帶模糊1) DNA降解避免核酸酶污染2) 電泳緩沖液陳舊電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液3) 所用電泳條件不合適電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò)20V/cm，溫度30；巨大DNA鏈電泳，溫度應(yīng)15；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力4) DNA上樣量過(guò)多減少凝膠中DNA上樣量5) DNA樣含鹽過(guò)高電泳前通過(guò)乙醇沉淀去除過(guò)多的鹽6) 有蛋白污染電泳前酚抽提去除蛋白7) DNA變性電泳前勿加熱，

12、用20mM NaCl緩沖液稀釋DNADNADNA電泳常見(jiàn)問(wèn)題分析電泳常見(jiàn)問(wèn)題分析問(wèn)題問(wèn)題原因原因解決辦法解決辦法不規(guī)則不規(guī)則DNA帶遷移帶遷移1) 對(duì)于/Hind III片段cos位點(diǎn)復(fù)性電泳前于65加熱DNA 5分鐘，然后在冰上冷卻5分鐘2) 電泳條件不合適電泳電壓不超過(guò)20V/cm；溫度30；經(jīng)常更換電泳緩沖液3) DNA變性以20mM NaCl Buffer稀釋DNA，電泳前勿加熱帶弱或無(wú)帶弱或無(wú)DNA帶帶1) DNA的上樣量不夠增加DNA的上樣量；聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高，上樣量可適當(dāng)降低2) DNA降解避免DNA的核酸酶污染3) DNA走出凝膠縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度4) 對(duì)于EB染色的DNA，所用光源不合適應(yīng)用短波長(zhǎng)（254nm）的紫外