人胃泌素(Gastrin)酶聯(lián)免疫分析(精)

1、人胃泌素(Gastrin)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用產(chǎn)品編號：CSB-E09166h檢測范圍：3.12 ng/ml - 200 ng/ml最低檢測限：0.78 ng/ml特異性： 本試劑盒可同時檢測天然或重組的人胃泌素，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。有效期：6個月預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中胃泌素 含量。說明1.試劑盒保存：-20c(較長時間不用時)；2-8c(頻繁使用時)。2濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。3.中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。4.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣

2、物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造 成任何影響。實驗原理用純化的抗體包被微孔板， 制成固相載體， 往包被抗胃泌素抗體的微孔中依次加入標(biāo)本 或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗胃泌素抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯 色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的胃泌素呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(0D值)，計算樣品濃度。試劑盒組成及試劑配制1.酶聯(lián)板(Assay plate )：一塊(96孔)。2.標(biāo)準(zhǔn)品 (Standard) ：2瓶(凍干品)。3.樣品稀釋液( (Sample Diluent):1 20ml/瓶。4.生

3、物素標(biāo)記抗體稀釋液(Biotin-antibody Diluent):1 X10ml/瓶。5.辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液(HRP-avidin Diluent) :1 xiOml/瓶。6.生物素標(biāo)記抗體(Biotin-antibody):1 X120卩1瓦(1:100)7.辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素(HRP-avidin) :1刈20卩1瓦(1:100)8.底物溶液(TMB Substrate) :1 X10ml/瓶。9.濃洗滌液(Wash Buffer):1 X20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。10.終止液(Stop Solution) :1 X10ml/瓶(2N H2SO4)。

4、需要而未提供的試劑和器材1.標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀2.高速離心機(jī)3.電熱恒溫培養(yǎng)箱4.干凈的試管和Eppendof管5.系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，最好用多通道移液器6.蒸餾水，容量瓶等 標(biāo)本的采集及保存1.血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4C過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20C或-80C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。2.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8 C1000 g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20C或-80C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。3.細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放 于

5、-20C或-80C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注：標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。標(biāo)本的稀釋原則： 首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測樣本的大致含量， 確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。 只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn) 曲線的范圍內(nèi)， 檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。 稀釋的過程中， 應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。最后計算濃度 時，稀釋了“N倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N。標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上， 然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解， 其濃度為200 ng/ml，做系列倍比稀釋后， 分別稀釋200 ng/ml，100 ng/ml，50 ng/ml，25 ng/ml，12.5 ng

6、/ml，6.25 ng/ml，3.12 ng/ml，樣品稀釋液直接作為 標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制100 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）200 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則： 臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100（il,實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10卩1生物素標(biāo)記抗體加990口1生物素標(biāo) 記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。操作步驟 實驗開始前， 請?zhí)崆芭渲煤盟?/p>

7、試劑， 試劑或樣品稀釋時， 均需混勻， 混勻時盡量避免起泡。 每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 如樣品濃度過高時， 用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋， 以使樣品符合試 劑盒的檢測范圍。1.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00卩,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100卩,注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸 及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37C反應(yīng)120分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液1001（取1卩生物素標(biāo)記抗體加99卩1生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配

8、制），37C,60分鐘。3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，200卩/每孔，甩干。4.每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液）100卩,37C,60分鐘。5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，200卩/每孔，甩干。6.依序每孔加底物溶液90卩,37C避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔顯色不明顯，即可終止） 。7.依序每孔加終止溶液50卩,終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。 為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性， 底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡

9、快加入 終止液。8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內(nèi) 進(jìn)行檢測。辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則： 臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋， 總量配制（每孔100卩），實際配制時應(yīng)多配制 素加990卩1辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 配制。稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的0.1-0.2ml。如10卩辣根過氧化物酶標(biāo)記親和的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)注：1.用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。2.每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔， 該孔不加任何試劑， 只是最后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用

10、此孔調(diào)OD值至零。3.為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。4.未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8C保存。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn) 品、生物素標(biāo)記抗體工作液、或辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。5.建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。洗板方法手工洗板方法： 吸去（不可觸及板壁） 或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體； 在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙， 酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需 要，重復(fù)此過程數(shù)次。自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。 計算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)） ，OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)） ，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪 出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度； 再乘以稀釋倍數(shù)； 或用標(biāo)準(zhǔn)物 的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式， 將樣品的OD值代入方程式， 計算出樣 品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。注意事項1.當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。2.洗滌過程非常重要，不充分的洗