細胞組織裂解(提蛋白)方法(共4頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上第一種方法專心-專注-專業(yè)蛋白勻漿緩沖液：50 mM Tris-HCl (pH7.5)150 mM NaCl5 mM EDTA1 % NP-401 mM PMSF操作步驟直接用這個進行組織勻漿然后于10000 rpm 離心20分鐘收集上清作SDSPAGE電泳從染色的情況來看所得到的總蛋白純度都不錯條帶比較清晰。我是作的小鼠八種常規(guī)組織也包括腎臟在內(nèi)。將抽提好的蛋白分裝后直接放在負八十保存。上樣大概38ul每孔都可以的具體看個人需要。70v濃縮，150v分離第二種方法裂解液配方：尿素：8MCHAPS:4%DTT:65mM(現(xiàn)加）PMSF:1mM(現(xiàn)加）MiliQ 水操作

2、步驟：取300mg樣品在液氮環(huán)境下研磨，加入1ml裂解液混勻，室溫靜置1小時（實驗證明改為勻漿更好，蛋白降解輕），15000g離心1小時，取上清測定蛋白質(zhì)濃度。在裂解液中加IPG buffer有兩個作用:1,增強蛋白質(zhì)的溶解性2,可以結(jié)合核酸,在沉淀的時候予以除去。建議最好加，濃度從0.5-2%不等（這取決于您樣品蛋白質(zhì)的難溶程度）。IPG buffer 是載體兩性電解質(zhì)，IPG buffer另外一個作用是促進蛋白質(zhì)溶解的,所以IEF前一定要加，裂解液中沒有IPG buffer可以么？（可以的，最后上膠條的時候可以再加）不過，我覺得液氮研磨以后，最好是粗離心一下，把一些結(jié)締組織給離心掉（150

3、g既可）然后再加裂解液。裂解液加1ML應(yīng)該沒什么問題，主要取決你以后蛋白的濃度。用這個方法最好經(jīng)丙酮沉淀一次比較好）第三種方法建議最好加完裂解液后再用超聲波破碎，我做肝臟蛋白提取時一般采取400W工作10秒，間歇10秒，次數(shù)15次，一次結(jié)束后大約30分鐘再重復(fù)上述步驟一次（因為不同的樣品用一根超聲柱子，可能會導(dǎo)致污染，所以一定要用雙蒸水沖洗干凈，再用70%乙醇洗一下，再用水洗一次），另外樣品超聲時要置于冰浴中，以免產(chǎn)熱做過的是用10ml蛋白裂解液來勻漿3克的組織，最終用考馬斯亮蘭染色法測得的蛋白濃度大概為 3050 ug/ul測595 OD值時，設(shè)定一個只用水的空白，把所有測得的值都減去這個空

4、白。再用減后的值做標(biāo)準(zhǔn)曲線。查得未知蛋白濃度時，也要用減后的值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得。培養(yǎng)細胞細胞培養(yǎng)于100 mL/L FCS+RPMI1640培養(yǎng)基中，待生長至對數(shù)生長期密度約為80%時用細胞括括下細胞離心收集按細胞/裂解液體積比1:10加入細胞裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，40 g/LCHAPS，65 mmol/L DTT)，同時加入1 mmol/L苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsufosyl，PMSF)，旋渦振蕩，反復(fù)液氮快速凍融4次，加Dnase50 mg/L和Rnase A 25 mg/L室溫作用15 min，4°C 15 000 g離心1 h，收集上

5、清液-80°C凍存?zhèn)溆?，Bradford法測定蛋白濃度17第四種方法哺乳動物組織一般采用機械分散法： 1 取腦組織稱重，研缽預(yù)冷，邊加液氮邊研磨，至非常細小的干粉。 2 0PBS洗劑組織碎片，43000g離心5分鐘，估算離心管底部沉淀物的體積。 3 在5倍組織體積預(yù)冷的懸浮緩沖液中迅速用鑷子分開或用剪刀剪碎組織碎片（最好加用蛋白酶抑制劑），大多數(shù)哺乳動物組織可以在懸浮緩沖液液面之下迅速用剪子分開或用用剪刀剪碎. 懸浮緩沖液： 0.1mol/L NaCl 0.01mol/L Tris Cl (PH 7.6) 0.001mol/L EDTA (PH8.0) 1g/ml Aprotinin

6、 100g/ml 苯甲基磺酰氟（PMSF） 4 盡快加入等體積的2×SDS凝膠加樣緩沖液。 5 樣品置于沸水浴中加熱10分鐘。6 采用帶有浸入尖頭或能在冷卻杯中同時處理多個樣品的超聲處理儀對DNA進行剪切。以最大功率處理0.52分鐘一般能有效將裂解液粘度降至可控水平。 7 室溫10,000g將樣品離心10分鐘，取上清。 8 計算使用Western法檢測靶蛋白所需樣品量。在細胞總提取液中加入已知量的靶蛋白同時進行Western blotting檢測，可為分析未知樣品提供陽性對照，并可精確估計采用所選抗體時該法的靈敏度?？煞駬Q成DNase 1 和RNase A? 可省去超聲操作我也是一名

7、初學(xué)者，我將要做的是大鼠腦膜蛋白的抽提。我拿到的裂解液的配方如下:1% SDS40 mM Tris65 mM DTT(現(xiàn)加）ddH2O而且在勻漿后，似乎還需要加入50ug/ml RNase和200ug/ml DNase,在4 放置15min;15000離心1h.取上清。我想請諸位高手指點一下，上面的配方和步驟中有無欠妥之處。謝謝！你的配方較適合水溶性蛋白的提取。8M尿素的加入能使膜蛋白更多地溶解，現(xiàn)在很多文獻提倡用7M尿素，2M硫脲提取膜蛋白。另外CHAPS、TritonX100、NP40等去垢劑的使用是否也要考慮？還有提取蛋白以后的下一步將做什么也很重要，如果是做IEF則最好不要用SDS，這

8、會影響等電點，如果還要做DIGE的話，在標(biāo)記熒光以前不能加DTT，標(biāo)好后可以加1IPG buffer 是載體兩性電解質(zhì)2WB時loading buffer 里DTT和巰基乙醇的作用？都是還原劑，防止二硫鍵形成3PAGE 上樣buffer中為什么要加DTT？作用是什么？DTT能增加雜質(zhì)的溶解，最主要的是DTT起還原劑的作用，用來打開肽內(nèi)或肽間的二硫鍵，促進蛋白的完全溶解。還是加的好。加入DTT可打開二硫鍵，基本成線性結(jié)構(gòu)；非還原狀態(tài)下，二硫鍵未被破壞，蛋白中由二硫鍵形成的雙體（如抗體的輕重鏈）或二級結(jié)構(gòu)不能打開，有時樣品會出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象。在進行WESTERNBLOT實驗時，有的抗體識別非還原狀態(tài)的

9、條帶，但不識別還原態(tài)下的蛋白條帶，就是由于非還原狀態(tài)下還保持了一定的空間表位，這在有些抗體的WB鑒定中很重要。所以你的SDSPAGE是否加DTT還是取決于你實驗的目的。4煮蛋白的作用是讓蛋白充分變性，這樣才能使蛋白在SDS-PAGE中完全靠分子量分離，測定的分子量準(zhǔn)確性才高。5. 去除核酸可以用酶法（DNase，RNase）、超聲，建議使用超聲。做WB什么的，抽提出的蛋白很粘稠就是因為有核酸，超聲把核酸降解了就可以了。若只是做WB，我覺得用RIPA可能更好一些，因為RIPA使用的三去污劑，裂解更完全些50mmTirs-Hcl 緩沖液（PH 7.5）,含：1、  150mm

10、Nacl 2、  1% NP-403、  1% 脫氧膽酸鈉4、  0.1%SDS5、  10mmEDTA6、  2.5mmEGTA7、  1mm釩酸鈉8、  50mmNaF9、  其它蛋白酶抑制劑 (無水乙醇溶解配成100X濃度，下述給出的為終濃度   Aprotinin (20 ug/ml)Benzamidine (1mm)Pepstatin (20ug/ml)PMSF (1mm)Leupetin (20ug/ml

11、)TPCK (100Ug/ml)2.RIPA buffer: 50 mM Tris-HCl pH 7.4 150 mM NaCl 1 mM PMSF 1 mM EDTA 5 礸/ml Aprotinin 5 礸/ml Leupeptin 1% Triton x-100 1% Sodium deoxycholate(脫氧膽酸鈉) 0.1% SDS Tris buffered saline (1x TBS): 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 150 mM NaCl 3.RIPA buffer: 1x PBS, 1% Nonidet P-40 or Igepal CA-630, 0.

12、5% sodium deoxycholate,0.1% SDS. This may be made in large volumes. Add inhibitors at time of use from the following stock solutions:a) 10 mg/ml PMSF (sc-3597)(in isopropanol (add at 10 l/ml RIPA)b) Aprotinin (sc-3595)c) 100 mM sodium orthovanadate (cat # sc-3540) in frozen aliquots (add at 10 l/ml

13、RIPA)Phosphate buffered saline (1x PBS): 9.1 mM dibasic sodium phosphate, 1.7 mM monobasic sodium phosphate, and 150 mM NaCl. Adjust pH to 7.4 with NaOHTISSUE SAMPLES 1. Weigh tissue and dice（切） into very small pieces using a clean razor blade. Frozen tissue can be sliced very thinly and thawed in l

14、ysis buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors. Use 3 ml of ice cold RIPA buffer per gram of tissue.2. Further disrupt and homogenize（使均勻） tissue with a dounce homogenizer（高速攪拌器） or a sonicator（超聲儀）, maintaining temperature at 4° C throughout all procedures. (Optional: Add 30 l of 10 mg/ml PMSF (cat # sc-3597 stock per gram of tissue.) Incubate on ice for 30 minutes.3. Transfer to microcentrifuge tube (General Laboratory Support Pr