實驗步驟方法

1、第一章 DNA及RNA實驗第一節(jié) 組織和細胞RNA的制備1、樣品處理：（1）培養(yǎng)細胞：懸浮細胞：收獲細胞2-4×106，移入1.5ml離心管中，加入1mlTrizol，混勻，室溫靜置5min。（2）貼壁細胞：將細胞棄去培養(yǎng)基，用冰浴的PBS洗滌一次，之后在培養(yǎng)皿中加入Trizol（以一個80-90%融合度的6cm培養(yǎng)皿加入1ml的Trizol為準），用槍吹打貼壁的細胞，待細胞完全吹打下來，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中。（3）組織：取50-100mg組織（新鮮或-70 及液氮中保存的均可）置1.5ml離心管中，加入1mlTrizol充分勻漿，室溫靜置5min。2、加入0.2ml氯仿，震蕩15

2、s，靜置2min，4離心，12000rpm×15min，取上清。3、加入0.5ml異丙醇(或與上清等體積），將管中液體輕輕混勻，靜置10min，4離心，12000rpm×10min，棄上清。4、加入1ml75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4，7500 rpm×5min，棄上清。5、重復用乙醇洗滌一次。6、在室溫中放置10min晾干，20-30ul加入適量的DEPC水溶解（65促溶10-15min）注意事項：1、細胞量和Trizol的加入量一定要按步驟1的比例，不能隨意增加樣品量或減少Trizol量，否則會是內(nèi)源性RNase的抑制不完全，導致RNA降解。2、在細胞加入Tri

3、zol裂解后，如近期不需要使用RNA，可將Trizol裂解的細胞暫存于-80中。3、實驗過程必須嚴格防止RNase的污染。提取RNA所使用的鑷子、飯盒等需要經(jīng)過高溫烘烤后才可使用；RNA提取所使用的槍頭、EP管均均為RNA提取專用，普通槍頭及EP管需要用DEPC浸泡、消毒后使用。4、要避免沉淀完全干燥，否則RNA難以溶解。試劑制備：75%乙醇（DEPC配制）：DEPC水：第二節(jié) 逆轉(zhuǎn)錄PCR【使用Fermentas ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit】1、取RNase-free的0.2微量離心管，冰上依次加入下列試劑的混合物至管中：試劑體積（ml）

4、總RNA（0.1-5ug）XOligo(dT)18 primer （0.5 mg/ml）1.0RNA-free H2OYX+Y=11 ml，溫和混勻，65孵育5 min后迅速置于冰上。5× reaction buffer 4.010 mM dNTP Mix2.0RiboLockTM Ribonuclease Inhibitor （20 U/ml）1.0RevertAidTM M-MuLV ReverseTranscriptase （200 U/ml）1.0 溫和混勻，42 反應60 min，70 孵育10 min終止反應，冰上冷卻。注意事項1、在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RN

5、Ade完整性。2、實驗中所有物品都應避免RNA酶的污染。操作過程中均應戴手套。第三節(jié) 引物設計一、引物設計總體原則：1、配對引物區(qū)長度約20-24bp，GC含量比40-60%，盡量無多個連續(xù)的核苷酸序列（大于4個）；2、引物的3端不能被封閉，3端無較長的自身發(fā)卡結(jié)構(gòu)（大于2個）；3、引物總長度最好不要超過40bp，特殊引物除外；二、基因克隆引物的設計：1、引物設計使用Primer Premier 5.0軟件(簡稱PP 5.0)進行；2、首先將克隆的基因序列拷貝至PP 5.0軟件中，保證所克隆基因的起始密碼子位于30bp之后（即31bp開始為ATG。），基因的末端保證在終止密碼子之后依然有超過2

6、0bp的延伸序列；3、點擊Enzyme選項進行酶切分析，找到不能切割序列的酶（Non-cutters），從中選擇較為常用的兩個酶（如Hind3、EcoR1、Xho1、BamH1和Kpn1等）進行克隆，同時注意此酶必須在目的載體的多克隆序列內(nèi)；4、點擊“primer”進行引物設計，先設計正向引物，將“S/A”選鈕點至“S”，將引物序列固定至所需要克隆的起始端，點擊“edit primers”，減去數(shù)個堿基后點擊“prime”進行引物分析，觀察引物的Tm值（60-70）、GC比例（40-60%），盡量符合此條件；5、在5端加上酶切序列，在酶切序列和配對序列之間斟情加減堿基以防止錯碼，在酶切序列之前

7、添加3個保護堿基，保護堿基的序列可參考“NEB限制性內(nèi)切酶保護堿基表”或以個人習慣而定，最后將序列拷貝出；6、反向引物設計時，先將“S/A”點至“A”，同理進行設計，注意反向引物如果后續(xù)有標簽序列，不能將終止密碼子設計入引物中；三、普通PCR引物設計：普通PCR引物長度在18-22bp之間，引物需要跨內(nèi)含子（即不同引物需要在不同的外顯子之上），GC比例在40-60%之間，利用PP5.0分析上下游引物的退火溫度在55-60左右，所PCR產(chǎn)物長度在100-250bp之間。第四節(jié) 目的基因基因克隆及PCR一、 實驗原理PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應)是一種選

8、擇性體外擴增DNA或RNA的方法.它包括三個基本步驟: (1) 變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94下解鏈; (2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最適溫度下,以目的DNA為模板進行合成.由這三個基本步驟組成一輪循環(huán),理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴增一倍，這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使DNA擴增達106 倍。二、 主要成分1. 引物：PCR反應產(chǎn)物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR

9、成敗的關(guān)鍵。2. 4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)：dNTP應用NaOH 將pH調(diào)至7.0，并用分光光度計測定其準確濃度。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分裝，-20貯存。一般反應中每種dNTP的終濃度為20-200mol/L。理論上4 種 dNTP各20mol/L，足以在100l反應中合成2.6g的DNA。當dNTP終濃度大于50mmol/L時可抑制Taq DNA聚合酶的活性。3Mg2+：Mg2+濃度對Taq DNA聚合酶影響很大，它可影響酶的活性和真實性，影響引物退火和解鏈溫度，影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+ 濃度范圍為0.5-2mmol/L。對于一種新的PC

10、R反應，可以用0.1-5mmol/L的遞增濃度的Mg2+ 進行預備實驗，選出最適的Mg2+濃度。在PCR反應混合物中，應盡量減少有高濃度的帶負電荷的基團，例如磷酸基團或EDTA等可能影響Mg2+ 離子濃度的物質(zhì),以保證最適Mg2+ 濃度。4. 模板：PCR反應必須以DNA為模板進行擴增，模板DNA可以是單鏈分子,也可以是雙鏈分子,可以是線狀分子,也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴增效果稍好).就模板DNA而言,影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度。5. Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5 130min，95 40min，97 5min。6. 反應緩沖液：

11、反應緩沖液一般含10-50mmol/L Tris·Cl (20下pH8.3-8.8)，50mmol/L KCl和適當濃度的Mg2+。Tris·Cl在20時pH為8.3-8.8，但在實際PCR反應中,pH為6.8-7.8. 50mmol/L的KCl有利于引物的退火。另外，反應液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DDT)或100g/ml的牛血清白蛋白(BSA),它們可穩(wěn)定酶活性，另外加入T4噬菌體的基因32蛋白則對擴增較長的DNA片段有利.各種Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。三、 操作步驟1. 在冰浴中，將以下各成分加入一無菌0.2ml離心管中。10×

12、;Pfu Buffer5ul10×LA Buffer5uldNTP(2mM)4uldNTP(2mM)10ul模板1ul模板1ul上游引物1ul上游引物1ul下游引物1ul下游引物1ulPfu酶0.5ulPfu酶0.5ulddH2O37.5ulddH2O31.5ul總體積50ul總體積50ul2. 調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93 預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93 30s58 30s72 30s，循環(huán)30次，最后在72保溫7min。3. 結(jié)束反應，PCR產(chǎn)物放置于4待電泳檢測或-20長期保存。4. PCR的電泳檢測：取PCR產(chǎn)物加

13、6×上樣緩沖液，電泳檢測。四、 注意事項1. PCR非常靈敏, 操作應盡可能在無菌操作臺中進行。2. 吸頭、離心管應高壓滅菌, 每次吸頭用畢應更換, 不要互相污染試劑。3. 加試劑前, 應短促離心10秒鐘, 然后再打開管蓋, 以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側(cè)面。4. 應設含除模板DNA所有其它成分的負對照。5.如果使用質(zhì)?；蚣兓玫腄NA片段當模板，模板量應在10-50ng內(nèi)。第五節(jié) 膠回收1、使用TBE緩沖液制作瓊脂糖凝膠，然后對目的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳。2、在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。3、稱量膠塊重量，切碎膠塊，按1mg：1ul

14、的比例加入Binding Buffer4、均勻混合后，60加熱直至膠塊融化，此時應間斷振蕩混合，可使膠塊充分融化5、膠融化后，待恢復至室溫，將膠塊融化液加入到Column中，靜置2-3min，12000rpm離心1min6、將Collection Tube中的膠塊融化液倒入Column中， 12000rpm 1min再離心一次，以提高回收率7、棄濾液，加入650ulWashing Buffer，12000rpm離心1min 8、棄濾液，再加入650ulWashing Buffer，12000rpm離心1min 9、棄濾液，12000rpm開蓋空離2min，Column放置于新的1.5ml的離心

15、管上，在Column膜中央處加入30-50ul的滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置3min。（注：把滅菌蒸餾水或Elution Buffer加熱至60使用時有利于提高洗脫效率）10、12000rpm離心1min第六節(jié) 酶切限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。1.將以下各成分加入一無菌0.2ml離心管中。內(nèi)切酶Buffer3ul內(nèi)切酶Buffer2ul內(nèi)切酶I1ul內(nèi)切酶I1ul內(nèi)切酶II1ul內(nèi)切酶II1ul待切DNA片段2ug待切質(zhì)粒2ugddH2O加水至30ulddH2O加水至20ul總體積30ul總體

16、積20ul2. 混勻反應體系后,將eppendorf管置于適當?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希糜?7 酶切1h以上，使酶切反應完全，80 5min使酶失活。3.電泳檢測第七節(jié) 連接及轉(zhuǎn)化1、取新的經(jīng)滅菌處理的0.2ml eppendorf管, 編號。2、將10-100ng酶切后回收的載體DNA轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，加3-10倍摩爾量的外源DNA片段。3、加入10×T4 DNA ligase buffer 1l, T4 DNA ligase 0.5l, 加蒸餾水至體積為10l,混勻后用微量離心機將液體全部甩到管底,于室溫（20-25）孵育2小時。4、取分裝好的100ul感受態(tài)菌，置于

17、冰上，待化開后無菌操作加入10ul連接產(chǎn)物，輕柔混勻，冰浴30min5、42熱激90s，緊接著繼續(xù)冰浴3min，無菌條件下加入300ul LB液體培養(yǎng)基，混勻，置于37搖床45min6、4000rpm，2min離心菌體，棄去上清液200l，將菌體沉淀吹打重懸并用無菌玻棒均勻涂布于篩選培養(yǎng)基上，37下培養(yǎng)半小時以上，直至液體被完全吸收。倒置平板于37繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時，待出現(xiàn)明顯而又未相互重疊的單菌落時拿出平板。7、用無菌槍頭挑取白色單菌落接種于含Amp 50g/ml的 5ml LB液體培養(yǎng)基中,37下振蕩培養(yǎng)12小時。注意事項1、DNA連接酶用量與DNA片段的性質(zhì)有關(guān)，連接平齊末端，必須加

18、大酶量，一般使用連接粘性末端酶量的10-100倍。 2、連接反應后，反應液在0儲存數(shù)天，-80儲存2個月，但是在-20冰凍保存將會降低轉(zhuǎn)化效率。 第八節(jié) 感受態(tài)的制備1、從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5單菌落,接種于3-5ml LB液體培養(yǎng)基中2、37下振蕩培養(yǎng)12小時左右,直至對數(shù)生長后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中,37振蕩培養(yǎng)2-3小時至OD600 0.5左右。 (注：以下操作均應在冰浴中進行。)3、將培養(yǎng)液50ml分裝入50ml離心管中。4離心，4000rpm 10min，棄去上清。4、用冰浴的0.1M MgCl2 20ml

19、懸浮30min5、4離心，4000rpm 10min，棄上清，加入冰浴的0.1M CaCl2甘油1ml懸浮，按100ul/管分裝到1.5ml離心管中。6、-70保存質(zhì)粒抽提1、 用1.5ml離心管收集1-5ml菌液，12000rpm離心1min，棄上清2、 加入250ul溶液I/RNase A混合液，漩渦劇烈振蕩直至菌體完全重新懸浮。室溫靜置1-2min。（初次使用試劑盒時，請將RNase A全部加入到溶液I中，均勻混合后于4保存）3、 加入250ul溶液II，輕柔地反復顛倒混勻5-6次。室溫靜置1-2min，使菌體充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。（注：若溶液II出現(xiàn)沉淀，清于37保溫溶解，

20、待恢復至室溫后使用；不可劇烈混合，否則會使染色體DNA斷裂；此步驟不宜超過5min）4、 加入350ul溶液III，立即輕柔地反復顛倒混勻5-6次。此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。5、 12000rpm室溫離心10min，收集上清。6、 將上清置于DNA純化柱中，靜置1-2min。（如果收集的上清液過多，超過DNA純化柱容積800ul，可將上清分次加入DNA純化柱中）7、 加入500ul溶液Washing Buffer，12000rpm離心1min，棄濾液8、 加入500ul溶液Washing Buffer，12000rpm離心1min，棄濾液9、 12000rpm離心3min，以徹底除去純化柱中殘留

21、的液體10、將純化柱置于新的離心管中，向純化柱中央膜處，懸空滴加30-100ulElution Buffer，室溫放置2min，-20保存第二章 蛋白質(zhì)實驗第一章 Western blot一、蛋白的提取及樣品的制備（一）組織蛋白的提取及樣品制備：1、從-80取出組織，融化后每100mg組織加入1ml蛋白裂解液，用剪刀剪碎，放置冰上裂解10min；2、冰上勻漿器勻漿，冰浴靜置30min后移置EP管中；3、4，14000g離心15min，取上清；4、測定蛋白濃度，調(diào)整分裝后按照2×上樣緩沖液：蛋白裂解液：DTT=5:4:1加入，煮沸5-10min，4，取出立即插入冰中冷卻，然后12000

22、g離心10min，取上清保存于-80，臨用時取出煮沸3min后上樣。（二）細胞蛋白的提取及樣品制備：1、細胞予0.01MPBS洗滌2次；2、加入1mlPBS后，細胞刮輕輕刮取細胞，移至1.5ml離心管中，1000g*5min離心收集細胞；3、加入配置好的蛋白裂解液加入細胞沉淀中，冰上裂解10min；4、12000g，5min離心收集蛋白上清，測定蛋白濃度；5、調(diào)整分裝后按照4×上樣緩沖液：蛋白裂解液：DTT=5:4:1加入；也可以配置2×上樣緩沖液，按照4×上樣緩沖液：蛋白裂解液：DTT=2.5:6.5:1加入；6、煮沸1015min，4，12000g，10min

23、離心，取上清保存于-80，用時取出煮沸3min后上樣。（三）分泌蛋白的提取及樣品制備：直接收集分泌液，照2×SDS loading buffer：細胞培養(yǎng)上清：DTT=5:4:1加入后煮沸。二、SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS-PAGE）1、裝好架子，檢查是否漏水；按照配方配制分離膠（下層膠），在膠上面加入一層異丙醇或蒸餾水，使膠平整，室溫聚合30min左右；2、洗去異丙醇（直到?jīng)]有氣味），配制濃縮膠，迅速攪拌后加入，加入時注意不要有氣泡，室溫聚合20min；3、上樣，電泳：上層膠用60-80V電壓，當樣品至分離膠時，用100-120V或者130V電壓；對小分子量的蛋白檢測（<

24、;100KDa）也可以采用120V電壓，不需要換電壓。一般電泳時間在1.5小時左右。三、轉(zhuǎn)膜1、電泳結(jié)束后，將膠剝出，切除上層膠和部分下層膠，置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15min；2、準備PVDF膜，在甲醇中透明1min，dH2O中洗去甲醇，膜停止轉(zhuǎn)動后放置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15min；3、切取與膠-膜大小相似的濾紙，置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15min；4、準備冰盒，將轉(zhuǎn)膜槽放入其中；5、從正極到負極（黑白）依次放好海綿墊、濾紙、膠條、PVDF膜、濾紙和海綿墊（注意膠和膜間不要有氣泡）；6、裝好電轉(zhuǎn)移儀，300mA轉(zhuǎn)移2h，板中出現(xiàn)由下向上溢出的氣泡后向冰盒中加入冰塊。【注意】1）濾紙、膠、膜之間的大小

25、，一般是濾紙>=膠>=膜；2）濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會造成短路；3）膜的疏水性，膜必須首先在甲醇中完全浸濕。而且在以后的操作中，膜也必須隨時保持濕潤。四、封閉：封閉緩沖液4°C封閉過夜或者室溫放入搖床2小時。五、抗體孵育1、將稀釋好的抗體和膜一起孵育，一般采用4°C過夜或者室溫2-3小時，可根據(jù)抗體量和膜上抗原量適當延長或縮短時間；（抗體一般用牛奶稀釋，注意封膜時不要有氣泡，否則氣泡處的膜與抗體接觸不完全）2、TBST洗5 min×3-5次；3、二抗孵育，室溫2 h；4、TBST洗5 min×3-5次。六、顯影1、ECL顯影，沖

26、洗膠片；2、Oderssay掃膜，并保存。七、試驗中所用到的試劑和緩沖溶液30% 丙烯酰胺丙烯酰胺29.2g雙丙烯酰胺 0.8gdH2O 定容至100ml2×分離膠緩沖液Tris base9.075 gSDS 0.2g調(diào)節(jié)pH=8.8 dH2O定容至100ml 2×儲備膠緩沖液Tris base3.025gSDS200mg調(diào)節(jié)pH=6.8 dH2O定容至100ml 10%過硫酸銨過硫酸銨100mgdH2O 1ml4×上樣緩沖液1M Tris-Cl（pH 6.8）20ml甘油40mlSDS 8g溴酚藍 1gdH2O 定容至100ml2×上樣緩沖液1M Tr

27、is-Cl（pH 6.8）10ml甘油20ml10%SDS40ml溴酚藍 0.5gdH2O 定容至100ml10×電泳緩沖液Tris30.2g甘氨酸188gSDS 10gdH2O定容至1000ml（使用時10×電泳緩沖液與dH2O以1:9稀釋）電泳緩沖液Tris3.02g甘氨酸18.8g10%SDS10mldH2O定容至1000ml10×轉(zhuǎn)膜緩沖液Tris3.03g甘氨酸14.4gdH2O定容至1000ml（使用時10×轉(zhuǎn)膜緩沖液與甲醇及dH2O以1:2:7稀釋）轉(zhuǎn)膜緩沖液Tris3.03g甘氨酸14.4g甲醇200mldH2O定容至1000ml10&#

28、215;TBST緩沖液 Tris24.2gNaCl 80gdH2O定容至1000 ml （使用時10×TBST緩沖液與dH2O以1:9稀釋，并加入0.5ml Tween 20）TBST緩沖液 Tris2.42gNaCl 8gTween 200.5mldH2O定容至1000 ml5%封閉緩沖液脫脂奶粉 5gTBST緩沖液100ml考馬斯亮藍R-250染色液考馬斯亮藍R-250 1g異丙醇250ml乙酸100mldH2O 定容至1000ml考馬斯亮藍染色脫色液乙酸100ml 乙醇 50mldH2O400ml麗春紅染色液麗春紅0.5g乙酸1mldH2O定容至100ml分離膠配方（10ml）

29、 6% 8% 10% 12%15%H2O2.9ml2.2ml1.6ml0.9ml 0ml30% 丙烯酰胺2.0ml2.7ml3.3ml4.0ml5.0ml2×分離膠緩沖液5.0ml5.0ml5.0ml5.0ml5.0ml10%過硫酸銨0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1mlTEMED 8ml 6ml 4ml 4ml 4ml濃縮膠配方（4ml）H2O1.5ml30% 丙烯酰胺0.5ml2×分離膠緩沖液2.0ml10%過硫酸銨0.04mlTEMED4ml免疫組化一、切片準備：1、石蠟切片：組織切片在60 恒溫箱中烘烤6-8 h，如果不是連續(xù)烤片，浸二甲苯前應在60 烤

30、0.5-1 h。（1）脫蠟：組織切片置于二甲苯中浸泡15分鐘,更換二甲苯后再浸泡15分鐘（2）水化：分別過無水乙醇95%乙醇80%乙醇70%乙醇自來水ddH2O冰凍切片：將切片放在37 烘烤1 h，然后置于組化PBS中浸泡，易脫片，一般不用高溫修復2、 抗原熱修復 a 高壓熱修復 先將高壓鍋中水煮沸，在瓷缸中加入0.01 M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH 6.0），將玻片置于金屬染色架上放入瓷缸內(nèi)后置于高壓鍋中，蓋上不銹鋼鍋蓋，緩慢加壓，待小閥門升起來后，繼續(xù)加熱3分鐘后除去熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。 b 沸熱修復 電爐或水浴鍋加熱0.01 M

31、的枸櫞酸鈉緩沖液（pH 6.0）至95 左右，放入組織切片加熱10-15分鐘。3、 自然冷卻至室溫，然后用PBST沖洗，涂指甲油或唇膏，此過程不要干片4,3%過氧化氫除去 酶？一、Dako試劑盒（僅適用于一抗為鼠和兔來源的分子）4、 滴加一抗，（1：50,1:100,1:200）一抗稀釋液稀釋（綠色），室溫靜置1 h，或者4度過夜，PBST洗3次各5分鐘，注意一抗種屬，5、 滴加二抗（A），室溫靜置半小時，PBST洗3次各5分鐘6、 DAB(濃縮液：稀釋液=1:20，有毒)顯色5分鐘，自來水沖洗5分鐘7、 蘇木精復染（染細胞核），鹽酸乙醇分色，自來水沖洗5分鐘8、 脫水、透明、封片、鏡檢。脫水

32、：70%乙醇3分鐘，80%乙醇3分鐘，95%乙醇5分鐘，無水乙醇5分鐘，然后取出室溫晾干透明：二甲苯各8分鐘封片：中性樹膠通用二步法：PV-9001（適用于鼠抗及兔抗），PV-9003（適用于羊抗）脫蠟水化及抗原修復步驟同前冷卻后，PBST洗3次每次5分鐘，然后用3% H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，37 孵育40 min，PBST洗3次每次5分鐘涂指甲油或唇膏，滴加一抗，室溫靜置1小時或4過夜（4 過夜后需37 復溫45分鐘），PBST洗3次每次5分鐘滴加二抗試劑一（黃色），37 20分鐘，PBST洗3次各5分鐘滴加二抗試劑二（紅色），37 半小時，PBST洗3次各5分鐘DAB顯色5分鐘，自來

33、水沖洗5分鐘 蘇木精復染，鹽酸乙醇分色，自來水沖洗5分鐘脫水、透明、封片、鏡檢。生物素放大法脫蠟水化及抗原修復同前冷卻后，PBST洗3次每次5分鐘，然后用3% H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，37 孵育40 min，PBST洗3次每次5分鐘涂指甲油或唇膏，封閉液封閉，室溫2 h，滴加一抗，室溫2 h，4 過夜，PBST洗3次每次5分鐘滴加生物素標記的二抗，PBS稀釋，1:1000，室溫2 h，PBST洗3次每次5分鐘滴加生物素放大用AB液，PBS稀釋，37 40 min，PBST洗3次每次5分鐘DAB顯色5分鐘，自來水沖洗5分鐘蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗5分鐘脫水、透明、封片、鏡檢。試

34、劑配制組化PBS(0.01 M) Na2HPO4·12H2O 3.23 g NaH2PO4·2H2O 0.45 g NaCl 8.00 g ddH2O 至1000 ml70%乙醇：368 ml 95%乙醇加ddH2O稀釋到500 ml80%乙醇：421 ml 95%乙醇加ddH2O稀釋到500 ml枸櫞酸鈉緩沖溶液：一小袋用2000 ml ddH2O溶解3% H2O2：30% H2O2：甲醇=1:9封閉液： 10%驢血清 0.3 ml 0.3% BSA 90 mg 0.1% triton X-100 3 L 0.05% Tween-20 1.5 L 0.01M PBS 2.

35、7 mlDAB：試劑C：試劑B=1:50鹽酸乙醇：濃鹽酸：70%乙醇=1 ml:500 ml注意事項：二甲苯在烘箱中加熱時必須將鼓風關(guān)掉，防止二甲苯揮發(fā)溢出。切片放入二甲苯及換缸時必須在通風櫥中進行，然后再拿到烤箱中。夏季二甲苯可不加熱。考片溫度不要超過62度抗原修復后，切片不能直接放到冷水中，要在修復液中冷卻到室溫。缸子外面可放冰塊以加速冷卻?？乖迯秃笠欢ú灰善?，否則容易產(chǎn)生非特異性著色DAB顯色后直接將切片放入自來水中，以免弄到濕盒內(nèi)造成污染。二甲苯更換時直接倒在通風櫥內(nèi)的空瓶子中，可用卷紙將缸內(nèi)蠟漬擦凈，然 后倒入新的二甲苯封片脫水時從無水乙醇中拿出后必須晾干，才能放入二甲苯中。而在

36、二甲苯中浸泡到時間不要干片，滴加中性樹脂蓋蓋玻片脫蠟和透明的二甲苯不可混用免疫組化問題解答1、染色過強a 抗體濃度過高或孵育時間過長 降低抗體滴度、抗體孵育時間：室溫1小時或4度過夜b 孵育溫度過高超過37度 一般在室溫20-28度2、非特異性背景染色a 操作過程中沖洗不充分 每步?jīng)_洗3次每次5分鐘b 組織中含過氧化物酶未阻斷 可再配置新鮮3% H2O2封閉孵育時間延長c 組織中含內(nèi)原性生物素 正常非免疫動物血清再封閉d 血清蛋白封閉不充分 延長血清蛋白封閉時間3、染色弱a 抗體濃度過低、孵育時間過短 提高抗體濃度、孵育時間不能少于60分鐘b 試劑超過有效使用時間 應更換試劑c 操作中添加試劑

37、時緩沖液未瀝干 每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液使試劑稀釋 （應防止切片干燥）d 室溫太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分鐘或4 度冰箱過夜e 蛋白封閉過度 封閉不要超過12分鐘4、染色陰性a 操作步驟錯誤 應重試 設陽性對照b 組織中無抗原 設陽性對照以驗證試驗結(jié)果c 一抗與二抗種屬連接錯誤 仔細確定一抗二抗種屬無誤。 免疫熒光細胞熒光：1. 種植細胞到小圓片上，37 孵育過夜2. 刺激細胞3. 固定：到達合適時間的細胞孔，棄掉原來的培養(yǎng)基，細胞用PBS洗一下，加入4%多聚甲醛固定，每孔300 L，室溫40 min或4 1 h，PBS洗，10分3次4. 封閉：將小圓片挑

38、出放到濕盒上，滴上封閉液，每片40 L，室溫2 h。（膜定位的分子封閉液里面不用加triton X-100）5. 一抗：封閉結(jié)束后，用濾紙在邊緣吸掉封閉液，直接滴加一抗，用1% BSA稀釋，室溫2 h，然后4 過夜6. 復溫0.5 h，PBS洗，5分3次7. 二抗：避光加入熒光二抗（1:1000），用PBS稀釋，4 孵育2 h，PBS洗，5分鐘3次8. 染核：Hochest或DAPI，用PBS稀釋，可以和二抗一起加，1:1000，PBS洗，10分3次（也可以單獨加，1:800，室溫20min）9. 封片：避光條件下，在載玻片上滴封片液，每個小圓片6 L，將小圓片倒扣在封閉液上，注意不要產(chǎn)生氣泡

39、。試劑配制：細胞用PBS NaCl 8.00 g KCl 0.20 g Na2HPO4·12H2O 1.44 g KH2PO4 0.24 g ddH2O 至1000 ml4% 多聚甲醛：多聚甲醛：PBS=1g：100 ml，按比例稱取后，于電爐上加熱，待溶解后，室溫冷卻后定容，然后定容，置于4度保存封片液：丙三醇：PBS=1:1 組織熒光1. 冰凍切片放在37 烘烤1 h，石蠟切片先脫蠟、水化、抗原修復，然后置于PBS中浸泡2. 涂指甲油，封閉液室溫封閉2 h3. 一抗：封閉結(jié)束后，甩掉多余的封閉液，直接滴加一抗，用1% BSA稀釋，室溫2 h，然后4 過夜4. 二抗：避光加入熒光二

40、抗（1:1000），用PBS稀釋，4孵育2h，PBS洗，5分3次5. 染核：Hochest或DAPI，用PBS稀釋，1:800，室溫20min，PBS洗，10分3次（也可以和二抗一起加，1:1000）6. 封片：避光條件下，在載玻片上滴封片液，每個玻片20 L，將小圓片倒扣在封閉液上，注意不要產(chǎn)生氣泡試劑配制：1% triton X-100：triton X：PBS=1ml：100 ml1% BSA：BSA：PBS=1g：100 ml細胞用PBS：NaCl 8g KCl 0.2 g NaHPO4 1.44 g KH2PO4 0.24 g ddH2O 1000 ml 可溶形式GST融合蛋白的親和

41、純化試劑：Lysis buffer (pH 7.5) 1 L Tris (50 mmol/L) 6.057 g NaCl (200 mmol/L) 11.688 g DTT(2mmol/L) HCl調(diào)節(jié)pH 至7.5GST Elution Buffer50mM Tris-HCl (pH 8.0)10mM Glutathione實驗步驟：1) 在50 ml離心管中加入適量lysis buffer（每克菌體加入25 ml lysis buffer，故需先初步估計菌體質(zhì)量）。2) 加入終濃度為1 mg/ml的溶菌酶，冰上放置裂解30 min。3) 冰浴超聲破碎菌體（工作3秒/冷卻6秒/200W 60

42、次）。12,000 rpm離心20-30 min，收集上清液，以0.45m濾膜過濾樣品。4) 輕混Glutathione Sepharose 4B 樹脂，使其與保存液混勻呈完全懸浮狀態(tài)。吸取一定量樹脂（1ml沉積的樹脂可純化5mg目的蛋白質(zhì)）懸液加到聚丙烯柱內(nèi)，使樹脂在重力作用下沉積。5) 以5倍柱體積的PBS (138mM NaCl , 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4）洗柱。6) 上樣，使樣品靠重力緩慢流過柱子。7) 以10倍柱體積PBS淋洗。8) 加入1倍柱體積的 GST Elution Buffer(50mM Tris-HCl (pH 8.0)

43、, 10mM Glutathione)，室溫孵育10 min后，收集流出液，其中含有被純化蛋白質(zhì)。9) 重復洗脫一次，純化后的蛋白取少量進行SDS-PAGE鑒定，剩余蛋白-80保存。10) 以5倍柱體積的PBS洗柱，再生柱子。 第二節(jié) 免疫共沉淀1、細胞予預冷的0.01MPBS洗滌2次；2、加入1ml PBS后，細胞刮冰上刮取細胞，移至1.5ml離心管中，1000g×5min離心收集細胞；3、加入配置好的500l細胞裂解液置于輪轉(zhuǎn)儀上4輪轉(zhuǎn)30min徹底裂解細胞，12000g 4離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至新EP管。4、預澄清 加入20l 混勻的Protein A/G beads，

44、在DNA混合儀上轉(zhuǎn)動1小時，900g 離心5min(4)，將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管，棄珠子。5、取40-60l上清液作為Input，加入等量2×SDS loading buffer，沸水煮5-10min，離心后凍存。其余部分平分為兩等分，分別加入等量（1g）Normal IgG 或相應抗體, 在DNA混合儀上轉(zhuǎn)動2小時（4）。6、在每個離心管中各加入30l 混勻的Protein A/G beads 繼續(xù)轉(zhuǎn)動2小時。然后900g 離心5min（4），棄上清。7、加入1ml洗滌緩沖液洗滌珠子。900g離心5min（4），共洗滌3次。最后將40-60l 2×SDS loading

45、buffer加入洗好的珠子中，沸水煮5-10min，離心后凍存。8、連同Input樣品一起進行Western blot檢測。裂解緩沖液的配制： 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 150 mM NaCl 5 mM EDTA (pH 8.0)5 mM EGTA15 mM MgCl21% Nonidet P-40臨用前加入： 1 mM Na3VO4 25 g/ml phenylmethylsulfonyl fluoride （PMSF） 1 mM -glycerophosphate 1× protease inhibitor cocktail洗滌緩沖液可直接用裂解液母液。 第

46、三章 細胞生物學實驗第一節(jié) 細胞培養(yǎng)一、細胞培養(yǎng)的注意事項細胞培養(yǎng)在細胞房內(nèi)進行，需嚴格遵守細胞房操作守則操作。特別指出的是：1、細胞房為細胞培養(yǎng)操作專用，不得在細胞房內(nèi)進行非細胞培養(yǎng)操作。凡是需要在細胞房培養(yǎng)細胞均需經(jīng)過允許，并登記備案。2、在細胞房培養(yǎng)細胞者嚴格按照其分配的位置擺放細胞培養(yǎng)物品、細胞及培養(yǎng)試劑，并在規(guī)定的操作臺使用。嚴禁在未告知對方的情況下隨意使用他人的培養(yǎng)基、細胞器材！3、在本細胞房培養(yǎng)細胞者進門時需要更換拖鞋、必須穿白大褂和戴手套（進行細胞操作必須佩帶乳膠手套），操作之前，必須用酒精噴壺噴灑雙手，保證雙手均進行過消毒。每次操作前請用紫外照射臺面，并擦拭臺面。培養(yǎng)瓶進入培

47、養(yǎng)箱前需要清潔其表面。如發(fā)生培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基漏出，立即用酒精棉將瓶外表面及箱內(nèi)污跡擦拭干凈。4、細胞操作完成之后，要清理臺面上任何遺留的東西，包括槍頭盒、滴管、手套和用完的培養(yǎng)皿等。廢液缸內(nèi)的廢液、槍頭和滴管需要及時清理，再放回超凈工作臺內(nèi)。5、細胞房值日的同學每天清理細胞房，每周四打掃細胞房一次（包括垃圾清理和拖地），并且配制75%的酒精及灌裝95%的酒精。及時補充培養(yǎng)箱內(nèi)無菌蒸餾水并應注意CO2濃度，發(fā)現(xiàn)問題及時報告。6、細胞培養(yǎng)箱需要每月25號進行消毒。培養(yǎng)細胞一經(jīng)污染，需要及時匯報，尋找污染原因，并及時清理污染的培養(yǎng)箱和培養(yǎng)基。二、細胞培養(yǎng)常用試劑的配制1、0.01mM PBS：NaCl

48、 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.44 g，KH2PO4 0.24 g，H2O 800 ml，攪拌溶解，定容至1 000 ml，高壓滅菌后4 保存。2、D-Hanks液：NaCl 80.0 g，Na2HPO4 0.6 g，KCl 4.0 g，KH2PO4 0.6 g，H2O 800 ml，攪拌溶解，定容至1 000 ml，高壓滅菌后4 保存。3、青霉素-鏈霉素儲存液：青霉素40萬U（5瓶）、鏈霉素4g（4瓶），H2O 400 ml，攪拌溶解，過濾滅菌后分裝，-20保存。使用時1:1000稀釋，終濃度為100 U/ml青霉素和100 g /ml鏈霉素4、0.25%胰酶：胰酶0

49、.25g，D-Hanks液 100ml，攪拌溶解，過濾滅菌后4 保存。5、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM干粉1瓶，NaHCO3 3.7g，HEPES 2.73g，H2O 800 ml，攪拌溶解，HCl調(diào)pH值至7.0，定容至1 000 ml，過濾滅菌后4 保存。6、DMEM完全培養(yǎng)基：含有10% 胎牛血清或者15%小牛血清，100 U/ml青霉素和100 g /ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，4保存。7、F-12培養(yǎng)基：F12干粉1瓶，NaHCO3 1.176g，H2O 800 ml，攪拌溶解，HCl調(diào)pH值至7.0，定容至1 000 ml，過濾滅菌后4 保存。8、DMEM/F12培養(yǎng)基：50%DM

50、EM培養(yǎng)基，50%F12培養(yǎng)基混勻。9、EMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基：EMEM干粉1瓶，NaHCO3 2.2g，H2O 800 ml，攪拌溶解，HCl調(diào)pH值至7.0，定容至1 000 ml，過濾滅菌后4 保存。10、RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基：RPMI1640干粉1瓶，NaHCO3 2.0g，H2O 800 ml，攪拌溶解，HCl調(diào)pH值至7.0，定容至1 000 ml，過濾滅菌后4 保存。11、RPIM1640完全培養(yǎng)基：含有10% 胎牛血清或者15%小牛血清，100 U/ml青霉素和100 g /ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，4保存。12、F-12K培養(yǎng)基：F12K干粉1瓶，NaHCO3 2.5g，

51、H2O 800 ml，攪拌溶解，HCl調(diào)pH值至7.0，定容至1 000 ml，過濾滅菌后4 保存。第二節(jié) 貼壁細胞的培養(yǎng)一、貼壁細胞的復蘇1、培養(yǎng)基復溫30min左右；2、準備好37恒溫水浴鍋；3、快速從-80冰箱取出凍存的細胞，至于37恒溫水浴鍋搖晃至完全融化，（慢?？焯K-保種時要慢，先在4放置20min，-20放置20min后再放入-80中保種；復蘇時要迅速）；4、取15ml離心管加入10ml完全培養(yǎng)基后加入溶解的細胞懸液，1000rpm離心5min；5、棄去上清液，用含有完全培養(yǎng)基重懸細胞，接種至細胞培養(yǎng)瓶中，置于37細胞培養(yǎng)箱；6、次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。二、貼壁細胞的傳代1、

52、D-Hanks、胰酶、培養(yǎng)基復溫30min左右；2、將D-Hanks、胰酶、培養(yǎng)基瓶蓋依次打開。準備好所需的吸管和移液管；3、將細胞從培養(yǎng)箱中取出，棄去廢舊的培養(yǎng)基，用D-Hanks洗1次；4、加入0.25%胰酶，消化至培養(yǎng)瓶壁上呈霧狀，棄去胰酶；5、加入完全培養(yǎng)基終止消化，用吸管將細胞從壁上吹下，并吹打成單細胞懸液；6、接種至新的培養(yǎng)瓶中，補足培養(yǎng)基，輕輕搖勻，標注細胞名稱、傳代日期及培養(yǎng)者姓名后置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日觀察。三、貼壁細胞的凍存1、D-Hanks、胰酶、培養(yǎng)基復溫30min左右；2、配制細胞凍存液，完全培養(yǎng)基中加入5-10%的DMSO（或者甘油，使細胞里的水滲到細胞外，防止細胞內(nèi)

53、形成冰晶）；3、將細胞從培養(yǎng)箱中取出，棄去廢舊的培養(yǎng)基，用D-Hanks洗1次；4、加入0.25%胰酶，消化至培養(yǎng)瓶壁上呈霧狀，棄去胰酶；5、用配制好的細胞凍存液吹打細胞，吹勻后分裝于1.5ml EP管中；6、標注細胞名稱和凍存日期，用封口膜包好。4放置半小時，-20放置半小時，保存至-80冰箱。第三節(jié) 懸浮細胞的培養(yǎng)一、懸浮細胞的復蘇：與貼壁細胞相同。二、懸浮細胞的傳代：因懸浮生長的細胞不貼壁，故傳代時不需要胰酶的消化。通常采取直接傳代或離心收集后傳代。（一）直接傳代：1、培養(yǎng)基復溫30min左右；2、在傳代前將細胞培養(yǎng)瓶豎立，讓懸浮細胞慢慢沉淀在瓶底下；3、將上清吸掉1/22/3,然后用吸管吹打成細胞懸液后，傳代接種。（二）離心傳代法1、培養(yǎng)基復溫30min左右；2、將細胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)；3、8001200r/min離心5min，然后去除上清；4、加新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，用吸管吹打使之形成細胞懸液，傳代接種。三、懸浮細胞的凍存