實驗二__蛋白質的顏色反應

1、實驗二實驗二 蛋白質的顏色反應蛋白質的顏色反應 一一 實驗目的實驗目的 1. 1.了解構成蛋白質的基本結構單位及主要聯(lián)了解構成蛋白質的基本結構單位及主要聯(lián)接方式。接方式。 2.2.了解蛋白質的顏色反應原理。了解蛋白質的顏色反應原理。 3.3.學習幾種常用的鑒定蛋白質的方法。學習幾種常用的鑒定蛋白質的方法。實驗原理(一一) ) 雙縮脲反應雙縮脲反應 1 1 原理原理 尿素加熱至尿素加熱至180180左右生成雙縮脲并放出一分子氨。左右生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環(huán)境中能與雙縮脲在堿性環(huán)境中能與cucu2+2+結合生成紫紅色化合物，此反應結合生成紫紅色化合物，此反應稱為雙縮脲反應。稱為雙縮

2、脲反應。 蛋白質分子中有肽鍵，其結構與雙縮脲相似，也能發(fā)生此蛋白質分子中有肽鍵，其結構與雙縮脲相似，也能發(fā)生此反應?？捎糜诘鞍踪|的定性或定量測定。反應。可用于蛋白質的定性或定量測定。 一切蛋白質或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應，但有雙縮一切蛋白質或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應，但有雙縮脲反應的物質不一定都是蛋白質或多肽。脲反應的物質不一定都是蛋白質或多肽。 ( (二二) ) 茚三酮反應茚三酮反應 除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應產生黃色物質外，所除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應產生黃色物質外，所有有氨基酸及一切蛋白質都能和茚三酮反應生成藍紫色物氨基酸及一切蛋白質都能和茚三酮反應生成藍紫色物質。質。

3、該反應十分靈敏，是一種常用的氨基酸定量測定方法。該反應十分靈敏，是一種常用的氨基酸定量測定方法。 茚三酮反應分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成茚三酮反應分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成COCO2 2、NHNH3 3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原性茚三酮同另一個水合茚三酮分子和氨縮合生成有成的還原性茚三酮同另一個水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質。色物質。COCOCOHOH+CCOOHHNH2RCOCOCHOH+RC HONH3CO2+加熱加熱COCOCHOH+COCOCCOCOCO+2NH3NH2COCOCN+2H

4、2O （三）黃色反應（三）黃色反應 在蛋白質分子中，具有芳香環(huán)的氨基酸在蛋白質分子中，具有芳香環(huán)的氨基酸( (如酪氨酸，色如酪氨酸，色氨酸等氨酸等) )殘基上的苯環(huán)經硝酸作用可生成黃色的硝基化合物，殘基上的苯環(huán)經硝酸作用可生成黃色的硝基化合物，在堿性條件下生成物可轉變?yōu)樯畛壬牡南貂苌?，反應在堿性條件下生成物可轉變?yōu)樯畛壬牡南貂苌铮磻獮椋簽椋?OH+HNO3HONO2+H2OHONO2+NaOHONOHOH 多數(shù)蛋白質分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以多數(shù)蛋白質分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以都會發(fā)生黃色反應。苯丙氨酸不易硝化，需加少都會發(fā)生黃色反應。苯丙氨酸不易硝化，需加少量濃硫酸后才能夠

5、發(fā)生黃色反應。量濃硫酸后才能夠發(fā)生黃色反應。 ( (四四) )考馬斯亮藍反應考馬斯亮藍反應 考馬斯亮藍考馬斯亮藍G250G250具有紅色和藍色兩種色調。在具有紅色和藍色兩種色調。在酸性溶液中，其以游離態(tài)存在呈棕紅色：當它與蛋酸性溶液中，其以游離態(tài)存在呈棕紅色：當它與蛋白質通過疏水作用結合后變成藍色。白質通過疏水作用結合后變成藍色。 它染色靈敏度高。反應速度快，約在它染色靈敏度高。反應速度快，約在2 2分鐘左分鐘左右時間達到平衡，在室溫一小時內穩(wěn)定。右時間達到平衡，在室溫一小時內穩(wěn)定。 在在0.01-1.0 mg0.01-1.0 mg蛋白質范圍內，蛋白質濃度與蛋白質范圍內，蛋白質濃度與A A59

6、5595nmnm值成正比。所以常用來測定蛋白質含量。值成正比。所以常用來測定蛋白質含量。實驗試劑實驗試劑v1 1 蛋白質溶液；蛋白質溶液；v2 0.12 0.1茚三酮水溶液；茚三酮水溶液；v3 3 濃硝酸；濃硝酸；v4 10%NaOH4 10%NaOH溶液；溶液；v5 5 尿素；尿素；v6 16 1硫酸銅溶液；硫酸銅溶液；v7 0.07 0.01 1考馬斯亮藍染液考馬斯亮藍染液實驗操作實驗操作（1 1）取少量尿素結晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素）取少量尿素結晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時，停止加熱，尿素放出氨，熔化。熔化的尿素開始硬化時，停止加熱，尿素放出

7、氨，形成雙縮脲。冷后，加形成雙縮脲。冷后，加1010氫氧化鈉溶液約氫氧化鈉溶液約1 1毫升，振蕩混毫升，振蕩混勻，再加勻，再加1 1硫酸銅溶液硫酸銅溶液1 1滴，再振蕩。觀察出現(xiàn)的粉紅顏滴，再振蕩。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色。色。 （2 2）向另一試管加卵清蛋白溶液約）向另一試管加卵清蛋白溶液約1010滴和滴和1010氫氧化鈉溶氫氧化鈉溶液約液約1010滴，搖勻，再加滴，搖勻，再加1 1硫酸銅溶液硫酸銅溶液2 2滴，隨加隨搖，觀滴，隨加隨搖，觀察紫玫瑰色的出現(xiàn)。察紫玫瑰色的出現(xiàn)。 (3) (3) 取試管取試管1 1支，加入蛋白質溶液支，加入蛋白質溶液1ml1ml，然后各加入，然后各加入0.10.1茚三酮水溶液茚三酮水溶液2 2滴，混勻后于沸水浴中加熱滴，混勻后于沸水浴中加熱1-21-2分鐘，觀察顏色由有粉色變紫紅色再變藍。分鐘，觀察顏色由有粉色變紫紅色再變藍。 (4) (4) 于一試管內，置蛋白質溶液于一試管內，置蛋白質溶液1010滴，濃硝酸滴，濃硝酸3-43-4滴，加熱，冷卻后于室溫下逐滴加入滴，加熱，冷卻后于室溫下逐滴加入10%NaOH10%NaOH溶液溶液5 5滴，滴，觀察顏色變化。觀察顏色變化。 (5) (5) 操作方法操作方法管號管號蛋白質溶液蛋白質溶液（mlml） 蒸餾水蒸餾水（mlml） 考馬斯亮藍考馬斯亮藍染液染液（滴