朱曉彤論文終稿

1、 本科畢業(yè)論文動物性食品中磺胺類藥物殘留ELISA方法檢測的建立Establishment of ELISA Methods and Kits for Rapid detection of Sulfonamides in the food of animals 學(xué) 院：獸醫(yī)學(xué)院專 業(yè)：動植物檢疫姓 名：朱曉彤學(xué) 號：121716570指導(dǎo)教師：郝永清職 稱：教 授 完成日期：二一六年五月摘 要磺胺類藥物是一類廣譜抗菌藥，廣泛用于預(yù)防、治療細(xì)菌性疾病，還常作為飼料添加劑長期在動物飼養(yǎng)過程中使用。大量實(shí)驗(yàn)證明長期使用磺胺類藥物不僅使人和動物產(chǎn)生耐藥性，還會引起人過敏性反應(yīng)，有致癌、致畸、致突變的作

2、用?；前奉愃幬锏牟缓侠硎褂靡呀?jīng)嚴(yán)重危害人類健康。因此，研究出一種操作簡便、快速、靈敏的磺胺類藥物殘留檢測方法，對于畜產(chǎn)品的安全具有實(shí)際意義。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)作為一種免疫學(xué)檢測技術(shù)不僅具有上述優(yōu)點(diǎn)，而且準(zhǔn)確性好、特異性強(qiáng)、檢測成本低，還可用于大批量樣品的檢測。本文是對北京維德維康生物技術(shù)有限公司獸藥殘留ELISA檢測方法建立及其效果進(jìn)行評價和討論。關(guān)鍵詞: 動物性食品 磺胺類藥物 殘留 檢測Abstract Sulfonamides are antibiotics which have wide antimicrobial spectrum. They are used to pre

3、vent and cure bacterial infections.SAS are usually added into forage to feed animals. But sulfonamides can cause anaphylactic reaction and carcinogenic mutagenic teratogenic. people. sulfonamide residues for its irrational use can affect people health .Therefore, it is significant to study a method

4、of sulfonamides detection in animal product security. Enzyme linked Immunosorbent assay(ELISA) is a convenient, fast, sensitive method,which has accurate and strong specificity . The method costs lowly and can detect a large number of samples. This article is based upon establishment and effect anal

5、ysis and discussion of the ELISA for detection of veterinary drug residues by Beijing WDWK Biotechnology Co., Ltd.Key words: Animal food; Sulfonamides; Residue; Detection目 錄1.引言11.1 磺胺類藥物的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)11.2 磺胺類藥物的毒性11.3 磺胺類藥物檢測方法2 1.3.1免疫測定方法2 1.3.2色譜定量技術(shù)41.4本文研究的目的及意義42 材料與方法52.1 實(shí)驗(yàn)材料5 2.1.1藥品5 2.1.2試劑5 2

6、.1.3 儀器設(shè)備52.2磺胺類藥物ELISA方法的建立6 2.2.1競爭性間接一步ELISA方法的選擇6 2.2.2單克隆抗體6 2.2.3包被抗原稀釋度、酶標(biāo)記物稀釋度以及抗體稀釋度的確定6 2.2.4酶標(biāo)板包被條件的確定7 2.2.6封閉時間的確定7 2.2.7酶標(biāo)記抗體反應(yīng)時間的確定7 2.2.8標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定7 2.2.9交叉反應(yīng)率確定7 2.2.10最低檢測限的確定8 2.2.11回收率的確定83結(jié)果與分析83.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果8 3.1.1包被抗原稀釋度、酶標(biāo)記物稀釋度以及抗體稀釋度的確定8 3.1.2酶標(biāo)板包被條件的確定9 3.1.3封閉液及稀釋倍數(shù)的確定9 3.1.4封閉時間的確定

7、10 3.1.5酶標(biāo)記抗體反應(yīng)條件的確定10 3.1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定10 3.1.7交叉反應(yīng)率的確定11 3.1.8最低檢測限的確定12 3.1.9回收率的確定124討論125.結(jié)論12致 謝13參 考 文 獻(xiàn)14內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 131引言 磺胺類藥物（sulfonamides，SAS）是一類人工合成的廣譜抗菌藥品，能影響細(xì)胞核蛋白質(zhì)的合成，抑制細(xì)菌的繁殖。因性質(zhì)穩(wěn)定、價格低廉、使用方便，被廣泛用于預(yù)防和治療細(xì)菌性疾病。SAS常配合抗菌增效劑作為飼料添加劑預(yù)防疾病的發(fā)生和促進(jìn)動物生長。SAS進(jìn)入動物體內(nèi)后，可轉(zhuǎn)移至肉、蛋、奶等動物源性食品中，過量的藥物殘留會對人類健康造成過敏、致

8、癌、致畸、致突變、耐藥菌株增加等危害。因此，多個國家制訂了SAS限量標(biāo)準(zhǔn)，我國規(guī)定動物源性食品中SAS的最高殘留限量為100g/ml。目前，我國檢測磺胺類藥物殘留檢測的方法很多，主要包括色譜法、免疫法兩大類，酶聯(lián)免疫法具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，成本低，操作簡單、便于推廣。1.1 磺胺類藥物的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)磺胺類藥物(SAS)是一類以對氨基苯磺酰胺作為基本結(jié)構(gòu)的人工合成抗菌藥，磺胺類藥物的骨架結(jié)構(gòu)(圖1)。其中，對位的兩個游離氨基是抗菌活性所必需的基團(tuán)。對位兩個R基被別的基團(tuán)取代即可得到其他磺胺類藥物。當(dāng)對位H離子被雜環(huán)取代，即可得到一些常用重要的磺胺類藥物，例如磺胺嘧啶(SD)、磺胺對甲氧嘧啶（

9、SMD）等。 圖1 磺胺類藥物基本結(jié)構(gòu)1.2 磺胺類藥物的毒性1.2.1引起毒性反應(yīng)大劑量磺胺類藥物攝入會出現(xiàn)神經(jīng)癥狀即急性中毒，如共濟(jì)失調(diào),麻痹，嘔吐，昏迷等。長期超劑量使用磺胺類藥物會出現(xiàn)慢性中毒，其代謝物損傷泌尿系統(tǒng)，出現(xiàn)結(jié)晶尿，蛋白尿等，抑制胃腸道菌群，引起菌群失調(diào)。1.2.2耐藥性細(xì)菌對磺胺類藥物產(chǎn)生耐藥性與細(xì)菌產(chǎn)生大量磺胺類藥物拮抗物對氨基苯甲酸有關(guān)。一旦產(chǎn)生耐藥性，即使劑量增加也很難奏效，病原菌對某一種磺胺類藥物產(chǎn)生耐藥性的同時對其他磺胺類藥物也易產(chǎn)生交叉耐藥性。1.2.3三致作用最近很多研究表明磺胺類藥物具有致畸、致癌、致突變作用，如果人們長期食用含有磺胺類藥物的動物源性食品，

10、對人類健康將造成無法估計的危害。1.2.4過敏反應(yīng) 許多研究表明，長時間食用含磺胺類藥物的動物源性食品可能會引起過敏反應(yīng)，引起皮膚過敏、搔癢和蕁麻疹，嚴(yán)重的甚至引起休克和死亡。1.2.5環(huán)境污染 磺胺類藥物隨著動物后排出的原藥或代謝產(chǎn)物由于仍然具有生物效應(yīng)，對周圍環(huán)境構(gòu)成潛在威脅。1.3 磺胺類藥物檢測方法 隨著科學(xué)技術(shù)的提高，檢測方法越來越多，現(xiàn)在用的較多的是免疫篩選和色譜定量技術(shù)。1.3.1免疫測定方法主要有酶聯(lián)免疫測定法（以酶進(jìn)行標(biāo)記通過與底物的顯色反應(yīng)來檢測），放射免疫測定法（用放射性進(jìn)行標(biāo)記來檢測），熒光免疫測定法（使用熒光或淺熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物來檢測）免疫親和色譜法（以免疫結(jié)合反應(yīng)

11、原理為基礎(chǔ)的色譜技術(shù)進(jìn)行檢測）廣泛地應(yīng)用于各種藥物殘留的初篩和檢測。1.3.1.1ELISA方法的原理 將可溶性的具有結(jié)合性的物質(zhì)（抗原，抗體）吸附在聚苯乙烯等固相載體上，其仍然具有生物活性。進(jìn)行檢測時，樣品中的受檢物質(zhì)（抗原或抗體）與固相載體上的抗體或抗原結(jié)合。通過洗板除去非結(jié)合物，再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，此時，能固定下來的酶量與樣品中被檢物質(zhì)的量相關(guān)。通過加入與酶反應(yīng)的底物后顯色，根據(jù)顏色的深淺可以判斷樣品中物質(zhì)的含量，進(jìn)行定性或定量的分析。1.3.1.2常見競爭ELISA方法直接一步法： 用抗體包被酶標(biāo)板，反應(yīng)時樣本與酶標(biāo)記物（抗原和抗體特異性結(jié)合物），標(biāo)準(zhǔn)品/樣本和酶標(biāo)記物競爭固相抗

12、體，洗滌除去過量酶標(biāo)記物，加底物A、B液，酶催化底物顯色見圖2，底物降解量=待測抗原量。這種方法樣本含待檢藥物少，和固相抗體結(jié)合的酶標(biāo)抗原量多，酶催化底物顯色深；樣本含待檢藥物多，和固相抗體結(jié)合的酶標(biāo)抗原量少，酶催化底物顯色淺。 圖2 直接一步法間接一步法： 用抗原包被酶標(biāo)板，反應(yīng)時標(biāo)準(zhǔn)品/樣本與酶標(biāo)記物（酶標(biāo)II抗與抗體特異性結(jié)合物）和抗體反應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)品/樣本與固相抗原競爭抗體，酶標(biāo)記物與抗體結(jié)合，洗滌除去過量酶標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品/樣本抗原-抗體-酶復(fù)合物，加底物A、B液，酶催化底物顯色（見圖3），底物降解量=待測抗原量。這種檢測方法樣本含待檢藥物少，和固相抗原結(jié)合的抗體量多，酶標(biāo)記物與抗體結(jié)合，

13、酶催化底物顯色深；樣本含待檢藥物多，和固相抗原結(jié)合的抗體量少，酶標(biāo)記物與抗體結(jié)合，酶催化底物顯色淺。 圖3 間接一步法間接兩步法用抗原包被酶標(biāo)板，反應(yīng)時加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本 + 抗體，標(biāo)準(zhǔn)品/樣本、固相抗原競爭抗體，溫浴30min后洗板，游離的標(biāo)準(zhǔn)品/樣本-抗體復(fù)合物被洗去，加酶標(biāo)記物（酶標(biāo)II抗和抗體特異性結(jié)合物），酶標(biāo)記物與抗體結(jié)合，洗滌除去過量酶標(biāo)記物，加底物A、B液，酶催化底物顯色（見圖4），底物降解量=待測抗原量。樣本含待檢藥物少，和固相抗原結(jié)合的抗體量多，酶標(biāo)記物與抗體結(jié)合，酶催化底物顯色深；樣本含待檢藥物多，和固相抗原結(jié)合的抗體量少，酶標(biāo)記物與抗體結(jié)合，酶催化底物顯色淺。 圖4 間接兩

14、步法1.3.2色譜定量技術(shù) 主要有薄層色譜法（用溶劑混合物作為流動相在硅膠板上分離再用熒光胺噴灑采用分光光度法測定但其靈敏度低只用作篩選），氣相色譜法（氣相色譜法是一種經(jīng)典的分析方法。）。液相色譜（高效液相色譜法是一種高效、快速的分析分離技術(shù)）。1.4本文研究的目的及意義 在藥物殘留檢測方面儀器分析法靈敏度高，結(jié)果可靠，但需要進(jìn)行復(fù)雜的樣品前處理，一次只能檢測少量樣品，先進(jìn)的儀器設(shè)備價格都比較昂貴，而且儀器的使用必須配備專業(yè)人員或進(jìn)行嚴(yán)格的培訓(xùn)，因此很難推廣。而基于抗原與抗體特異性反應(yīng)的免疫分析技術(shù)具有靈敏度高、快速、方便簡捷的特點(diǎn)，尤其適宜現(xiàn)場篩選和大量樣品快速分析。因此建立一種ELISA檢

15、測方法對磺胺類藥多殘留的檢測有著很重要的作用。2 材料與方法2.1 實(shí)驗(yàn)材料2.1.1藥品磺胺類藥物半抗原 購自美國sigma公司磺胺類藥物人工抗原 由北京維德維康公司原材料部提供羊抗鼠酶標(biāo)二抗 由北京維德維康公司原材料部提供辣根過氧化物酶 購自美國sigma公司乙腈 北京化工廠正己烷 北京化工廠2.1.2試劑包被液：磷酸鹽緩沖液PBS封閉液：主要成分有脫脂奶粉，酪蛋白，Tween-20，蔗糖，牛血清抗原稀釋液：維德維康2#稀釋液抗體稀釋液：維德維康3#稀釋液酶稀釋液：維德維康6#稀釋液洗滌液：0.05% Tween-20的PBS磷酸鹽緩沖液底物A液：0.01 M pH 7.4 PBS磷酸鹽緩

16、沖液底物B液：0.1 M pH 7.0 Tris-HCl溶液終止液：2 M H2S04（22.2 ml濃硫酸緩慢加入177.8 ml蒸餾水中）2.1.3儀器設(shè)備96孔酶標(biāo)板 德國GERENER電子天平 METTER AE260型酶標(biāo)儀 美國Thermo旋渦混合器 北方同正HQ-60-II移液器 芬蘭Finnpipette, 德國Eppendorf , 德國Brand（300L 八道移液器）恒溫培養(yǎng)箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司氮吹儀低俗臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠SH微孔甩板脫水儀 北京富眾科技有限公司自動洗板機(jī) 北京拓普分析儀器有限公司自動包被機(jī) 北京拓普分析儀器有限公司槍頭 美國AXYGE

17、N 一次性醫(yī)用乳膠手套 AMMEX醫(yī)用口罩 新鄉(xiāng)市康民衛(wèi)材開發(fā)有限公司 2.2磺胺類藥物ELISA方法的建立2.2.1競爭性間接一步ELISA方法的選擇 由于直接法（標(biāo)記抗原，與檢測樣品中的抗原競爭抗體）靈敏度不高，比較適合用于一種藥物殘留ELISA檢測，對于磺胺類藥物，一般選擇靈敏度較高的間接法（標(biāo)記抗體，固相抗原與液相抗原（樣品）競爭標(biāo)記抗體）。間接兩步法實(shí)驗(yàn)過程較為繁瑣，本實(shí)驗(yàn)采用間接一步法作為檢測方法。2.2.2單克隆抗體制備單克隆抗體購自美國sigma公司，純化和稀釋由維德維康原材料部完成。得到最后編號為SAS160307的成品。2.2.3包被抗原稀釋度、酶標(biāo)記物稀釋度以及抗體稀釋度

18、的確定 維德維康公司采用的是棋盤法，具體操作如下：（1） 抗原的包被：將稀釋倍數(shù)為1:5000,1:10000,1:20000,1:40000的抗原（用2#樣稀稀釋）每三列一個濃度，每孔100 l加入96孔酶標(biāo)板中。置4 恒溫箱16 h（包被條件的優(yōu)化選擇見2.2.4）。（2） 洗滌：用移液器每孔200 l加入洗滌液，洗四次每次洗滌液浸泡10-15s，最后用甩板機(jī)甩干。（3） 封閉：用脫脂奶粉+BSA+酪蛋白+蔗糖（4#）（選擇封閉液過程見2.2.5）恒溫37 封閉1 h（封閉條件選擇見2.2.6）。（4） 加酶：將酶稀釋為1:500,1:1000,1:2000（用6#樣稀稀釋），按順序每個濃

19、度添加一列，每孔50 l。（5） 加抗體：將稀釋倍數(shù)為1:5000,1:10000,1:2000,1:40000的抗體（3#樣稀稀釋）每個濃度添加兩行，每孔80 l：放入25 培養(yǎng)箱30 min。（酶標(biāo)記抗體反應(yīng)條件的確定見2.2.7）（6） 洗滌：用移液器每孔200 l加入洗滌液，洗四次每次洗滌液浸泡10-15 s，最后用甩板機(jī)甩干。（7） 顯色：將底物A液，底物B液按1:1混合（現(xiàn)用現(xiàn)配），每孔添加100L，反應(yīng)15-20 min。（8）終止：每孔加入50L的終止液，反應(yīng)10 s。（9）測OD值：在五分鐘內(nèi)測其OD值。2.2.4酶標(biāo)板包被條件的確定用確定下來的抗原濃度包板，包被條件最常見的

20、為37 2 h和4 16 h兩種。一般認(rèn)為16h條件下包被的抗原更加穩(wěn)定，但這種方法耗時稍長，所以根據(jù)不同項(xiàng)目應(yīng)進(jìn)行條件的比較，根據(jù)所得OD值選擇最佳包被條件。2.2.5封閉液及稀釋倍數(shù)的確定 維德維康封閉液分為5%脫脂奶粉(1#)，脫脂奶粉+BSA+酪蛋白(2#），脫脂奶粉+BSA+ Tween-20（3#）,脫脂奶粉+BSA+酪蛋白+蔗糖（4#），脫脂奶粉+BSA+酪蛋白+蔗糖+ Tween-20（5#）這五種。因?yàn)榭乖煌糠N獸藥殘留檢測試劑盒所用封閉液也不同。為了選擇最合適的封閉液，要做封閉液種類及稀釋度選擇試驗(yàn)。根據(jù)OD值選擇最佳封閉液種類及稀釋倍數(shù)。2.2.6封閉時間的確定封閉液

21、封閉時間一般分為37 1 h和25 2 h, 為了確定這兩種封閉條件哪種更適合磺胺類藥物，需要進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)測定的OD值進(jìn)行選擇。2.2.7酶標(biāo)記抗體反應(yīng)條件的確定在25 30 min，25 1 h，37 30 min ，37 1 h四個反應(yīng)條件中根據(jù)其OD值選擇最佳反應(yīng)時間。2.2.8標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定 維德維康公司標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定采用六點(diǎn)法，即稀釋六個梯度的抗體測其OD值。根據(jù)公司要求零標(biāo)OD值控制在1.6-2.0，第一抑制率在60%-90%，曲線相關(guān)系數(shù)控制在0.99以上，拐點(diǎn)數(shù)為2即為合格。2.2.9交叉反應(yīng)率確定磺胺類藥物是一類含有對氨基苯磺酰胺作為基本結(jié)構(gòu)的藥物，許多藥物之間結(jié)構(gòu)和特性相

22、似，因此需要測其交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)率是指已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50（抑制率為50%時所對應(yīng)的藥物濃度）與待測物的結(jié)構(gòu)類似物、代謝物IC50的比值100%。2.2.10最低檢測限的確定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的IC50（抑制率為50%時所對應(yīng)的藥物濃度）來確定最低檢測限。IC50附近，曲線梯度變化明顯在這個梯度內(nèi)OD值是穩(wěn)定的檢測最準(zhǔn)確。2.2.11回收率的確定回收率是指所能檢測出的添加藥物的量與實(shí)際添加量的比值乘以100%?；厥章士梢院芎玫姆从吃噭┖械奶禺愋院挽`敏度，回收率偏高說明特異性不強(qiáng)，回收率偏低說明靈敏度太低。公司要求試劑盒回收率必須在60%-120%。檢測回收率一般通過對空白陰性樣本，添加

23、一倍最低檢測限的高濃度標(biāo)準(zhǔn)品的陰性樣本，添加兩倍最低檢測限的高濃度標(biāo)準(zhǔn)品的陰性樣本做ELISA實(shí)驗(yàn)測其OD值計算濃度，進(jìn)而確定回收率。3結(jié)果與分析3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1.1包被抗原稀釋度、酶標(biāo)記物稀釋度以及抗體稀釋度的確定 將抗原（維德維康公司提供）按1:5000,1:10000,1:20000,1:40000的比例稀釋，將編號為SAS160307的抗體按1:5000,1:10000,1:2000,1:40000的比例稀釋。將酶（維德維康公司提供）按1:500,1:1000,1:2000的濃度稀釋。（其中抗原稀釋液為2#稀釋液，抗體稀釋液為3#稀釋液，酶稀釋液為6#稀釋液）。按照抗原200L酶5

24、0L，抗體80L的體系在96孔酶標(biāo)板進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)測OD值，檢測結(jié)果見表1。表1 不同抗原濃度，酶濃度，抗體濃度的OD值抗原稀釋度抗體稀釋度1:50001:100001:200001:400001:50002.6082.1641.7271.9511.8321.7161.1811.1501.8491.2650.7040.4772.4822.0391.8091.6671.7681.6251.2071.1631.7551.0560.6340.534 1:100002.0411.6791.3851.4051.8931.3101.9571.6891.0180.7100.4530.7662.0991.

25、8451.5191.9021.6751.3491.8971.7051.0210.6320.4700.897 1:200001.2981.1081.9231.8161.3620.9771.7551.2910.6310.6371.1910.3141.5180.4601.9721.6921.4291.0081.7361.2410.6950.8840.5430.475 1:400000.9200.7000.0961.4201.1721.7601.3461.0481.7340.0730.7440.0451.2840.6730.0501.4021.1931.7241.3251.0091.8380.0830

26、.7430.064按照公司規(guī)定，OD值要控制在1.6-2.0之間，在滿足OD值之后，從節(jié)省原材料的角度考慮選擇稀釋倍數(shù)較大的。因此抗原稀釋倍數(shù)為1:2000，抗體稀釋倍數(shù)為1:10000，酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為1:10000最為合適。3.1.2酶標(biāo)板包被條件的確定包板條件確定為4 16h。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）可以看出37包被2 h和4包被16 h測得的OD值都符合公司要求（1.6-2.0）。一般認(rèn)為16h包被更加穩(wěn)定，因此選擇4 16 h。表2 不同包被條件下測定的OD450封閉時間封閉溫度（）OD值2h371.6716h41.833.1.3封閉液及稀釋倍數(shù)的確定 封閉液確定為4#封閉液封閉液濃度為

27、0.25%。結(jié)果見表3，從表中顯示的數(shù)據(jù)可以得知從成本和封閉效果兩方面考慮脫脂奶粉+BSA+酪蛋白+蔗糖（4#）在封閉液濃度為0.25%時封閉效果較好。因此磺胺類藥物檢測試劑盒所用封閉液即為4#封閉液，濃度為0.25%。表3 封閉液選擇結(jié)果封閉液稀釋度 （%）封閉液種類0.10.250.511#0.9120.9741.3461.4242#0.8540.8361.6042.5313#1.3541.9472.5252.8424#1.0841.7852.3262.6745#1.4561.9802.6482.8523.1.4封閉時間的確定封閉時間為37 1 h 。通過表4可以看出兩種封閉條件下測得OD

28、值均符合公司要求（1.6-2.0）從效率上考慮，最終選擇37 1 h。表4 抗原封閉條件的確定孵育溫度（）封閉時間（h）OD值2521.7463711.8533.1.5酶標(biāo)記抗體反應(yīng)條件的確定 酶標(biāo)記抗體反應(yīng)條件最終確定為25 30 min。通過表4可以看出25反應(yīng)30 min與37反應(yīng)30 min均符合公司要求（OD值在1.6-2.0之間）。為了考慮檢測方法的推廣，降低成本便于實(shí)際操作，選擇25反應(yīng)30 min（25基本與室溫相當(dāng)可以不使用恒溫培養(yǎng)箱）。表5 酶標(biāo)記抗體反應(yīng)條件的確定反應(yīng)溫度（）反應(yīng)時間（min）OD值25301.73425602.07837301.96337602.2513

29、.1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定 此部分由維德維康試劑盒研發(fā)部完成，最后確定六個標(biāo)準(zhǔn)品工作液的濃度分別為濃度為0 ppb、2 ppb、6 ppb、18 ppb、54 ppb、162 ppb（ppb=ng/ml或ng/g）標(biāo)準(zhǔn)曲線參考圖見圖5，標(biāo)準(zhǔn)曲線OD值見表5。滿足公司要求：零標(biāo)OD值為2.060（雖然沒有嚴(yán)格控制在1.6-2.0，但在允許范圍內(nèi)），第一抑制率77.1%在60%-90%內(nèi)，曲線相關(guān)系數(shù)99.22%控制在0.99以上，拐點(diǎn)數(shù)為2。 圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線參考圖表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線OD值標(biāo)準(zhǔn)濃度ppbOD值B/BO%計算濃度ppb擬合誤差%0.0002.0601000.0002.90.3002.0317

30、7.10.3004.10.9001.32150.20.9002.92.7000.54820.82.7007.18.1000.2419.28.1003.824.3000.1074.124.3001.33.1.7交叉反應(yīng)率的確定交叉反應(yīng)率是已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50（抑制率為50%時所對應(yīng)的藥物濃度）與待測物的結(jié)構(gòu)類似物、代謝物IC50的比值100%。交叉反應(yīng)率的測定由維德維康試劑盒研發(fā)部完成，其測定結(jié)果如下SMZ（磺胺甲噁唑）100%SD（磺胺嘧啶）22%SM2（磺胺二甲基嘧啶）40%SM1（磺胺甲基嘧啶）49%SQX（磺胺喹噁啉）63% SMM（磺胺間甲氧嘧啶）63%SDM（磺胺二甲氧嘧啶）9

31、2% SMD（磺胺對甲氧嘧啶）89% SCP（磺胺氯噠嗪）38% SIM（磺胺索嘧啶）90% SMT（磺胺甲噻二唑）40% 3.1.8最低檢測限的確定經(jīng)維德維康公司試劑盒研發(fā)部反復(fù)試驗(yàn)，測得的最低檢測限為10ppb。3.1.9回收率的確定 通過大量的試驗(yàn)檢測全國多個地區(qū)的雞肉，雞肝，鴨肉，牛肉，羊肉，豬肉，豬尿，牛尿，羊尿，原奶，計算回收率在89%-110%，符合公司60%-120%的要求。（此部分由試劑盒研發(fā)部和試劑盒品管部共同完成）。4.討論 該檢測方法的建立的基礎(chǔ)是市面上已經(jīng)研究出磺胺母核結(jié)構(gòu)的半抗原，以及對應(yīng)的抗體。通過固相載體與抗原結(jié)合，固相抗原與抗體，酶反應(yīng)最后通過顯色來實(shí)現(xiàn)整個E

32、LISA的檢測方法。通過對ELISA檢測方法的各種要求，例如最佳的反應(yīng)體系，最低檢測限，零標(biāo)OD值，抑制率，標(biāo)準(zhǔn)曲線，來把檢測結(jié)果控制在一個準(zhǔn)確，有效的范圍內(nèi)。通過與國外研制的磺胺類獸藥ELIAS檢測試劑盒對比，各項(xiàng)指標(biāo)均在行業(yè)默認(rèn)范圍內(nèi)。5.結(jié)論動物性食品中磺胺類藥物檢測使用間接ELISA方法是可行的，ELISA方法的成功建立為獸藥殘留檢測提供了方便，而且它設(shè)備要求低，操作簡單利與推廣。但是此方法的結(jié)果會因?yàn)椴僮髡叩牟僮魇址ǎ瑯颖厩疤幚硎欠癯浞侄艿接绊?。因此，ELISA檢測是一種普篩方法，雖然他可以定性也可以定量，但是對于需要準(zhǔn)確測其含量的樣本，應(yīng)使用相關(guān)儀器做進(jìn)一步準(zhǔn)確測定。致 謝本論文是在郝永清老師的悉心指導(dǎo)下完成的，郝老師給予了我很多的支持和幫助，而且郝老師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)作風(fēng)和無私的育人品格使我受益匪淺，在此對郝老師的諄諄教誨、大力支持和幫助，表示最誠摯的謝意！ 在維德維康生物技術(shù)有限公司兩個月的實(shí)習(xí)中得到了領(lǐng)導(dǎo)以及同事的幫助和支持，向他們學(xué)到了很多知識，在此表示由衷的謝意！ 最后向所有理解、關(guān)心和幫助過我的老師和同學(xué)表示衷心的感謝！參 考 文 獻(xiàn)1 趙書景，賀紹君，袁逢新.動物性食品中磺胺類藥物殘留檢測方法的研究進(jìn)展J張衛(wèi)憲.中國畜牧獸醫(yī)雜志,2009,第8期2 張聞娟.雞肉中磺胺藥物殘留風(fēng)險