單克隆抗體研究進(jìn)展

1、生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)遺傳學(xué) 馮馮 剛剛抗體抗體(antibodyantibody)是機(jī)體在抗原刺激下產(chǎn)生的能與該抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。單克隆抗體單克隆抗體(monoclonal antibodymonoclonal antibody)是由淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的、只針對(duì)復(fù)合抗原分子上某一單個(gè)抗原決定簇的特異性抗體。特點(diǎn)特點(diǎn)：1.高特異性；2.高均一性；3.高單一性。1.定義：定義：1975年，淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)由Kohler和Milstein建立。致敏致敏B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞( sensitized B cells ) (能夠分泌特異性的抗體能夠分泌特異性的抗體 ，不，不能在體外長(zhǎng)期

2、生存能在體外長(zhǎng)期生存)骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞(myeloma) (不能分泌特異性的抗體，但能在體外不能分泌特異性的抗體，但能在體外長(zhǎng)期生存長(zhǎng)期生存)12陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞(hybridoma)克隆化培養(yǎng)克隆化培養(yǎng)（產(chǎn)生單克隆的陽(yáng)性（產(chǎn)生單克隆的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞）21222單克隆抗體單克隆抗體2.單克隆抗體單克隆抗體制備制備的基本原理的基本原理1生產(chǎn)單抗生產(chǎn)單抗3.單克隆抗體單克隆抗體制備過(guò)程制備過(guò)程4.研究進(jìn)展研究進(jìn)展4.1鼠源性抗體鼠源性抗體主要步驟包括：主要步驟包括：動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選與單抗檢測(cè)、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存、單抗的鑒定等。不足：不足：鼠源性抗

3、體作為異種蛋白應(yīng)用于人體可引起免疫反應(yīng)，產(chǎn)生人抗鼠抗體(human anti-mouse antibody,HAMA)，這在很大程度上限制了mAbs的臨床應(yīng)用。此外，鼠源性的mAbs不能與人類抗體FcRn結(jié)合。技術(shù)：技術(shù)：B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)。4.24.2人人源化源化抗體抗體4.2.1嵌合抗體嵌合抗體指的是鼠mAbs的恒定區(qū)基因被人Abs的恒定區(qū)基因通過(guò)基因重組技術(shù)所替換而編碼產(chǎn)生的單克隆抗體。這樣既能保持鼠單抗的特性，又使獲得的單抗降低了在人體內(nèi)的免疫反應(yīng)。4.2.2CDR移植抗體，又稱改型抗體，移植抗體，又稱改型抗體，是在嵌合抗體的基礎(chǔ)上，利用基因工程技術(shù)，進(jìn)一步用人的FR代替鼠FR，形成

4、的只剩3個(gè)鼠源CDR的、更為完全的人源化抗體。主要包括嵌合抗體、改型抗體和全人源化抗體。不足：由于具有支持作用的FR不僅為CDR的構(gòu)象提供了環(huán)境，還參與抗體結(jié)合位點(diǎn)正確構(gòu)象的形成和抗原的結(jié)合，常常使得CDR移植抗體的親和力和特異性大大降低，有的甚至還喪失了抗原結(jié)合能力。解決方案解決方案：選用與鼠源單抗具有高度同源性的人源抗體，但保留鼠源單抗中的一些關(guān)鍵氨基酸殘基，并在此基礎(chǔ)上，對(duì)鼠CDR和FR的一些表面氨基酸殘基進(jìn)行修飾或重塑，對(duì)關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行一定的改變，能在保留CDR移植抗體的親和力和特異性下，大大降低其免疫原性。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：人源化程度能達(dá)到70%以上， 有利于其在臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用與研究

5、。4.2.3全人源化抗體制備方法：噬菌體展示技術(shù)和轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)。(1)噬菌體展示技術(shù)基本原理： 將抗體重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）基因通過(guò)基因工程技術(shù)隨機(jī)插入噬菌體的外殼蛋白基因，繼而感染大腸桿菌，經(jīng)增殖并以抗體片段Fab或ScFv外殼蛋白融合蛋白的形式展示在噬菌體表面；利用靶分子，經(jīng)過(guò)“親和-洗脫-擴(kuò)增-親和”循環(huán)過(guò)程篩選，除去雜蛋白并富集特異性抗體。特點(diǎn)：實(shí)現(xiàn)了直接將基因型和表現(xiàn)型完美的結(jié)合在一起， 可以快速而高效地從大量克隆中篩選出表達(dá)特異性的抗體。存在的問(wèn)題： (1)抗體親和力相對(duì)較弱; (2)抗體多樣性無(wú)法滿足。目前已建立的噬菌體展示系統(tǒng)，如：絲狀噬菌體、l噬菌體、T4噬

6、菌體、T7噬菌體和真核病毒系統(tǒng)等。(2)轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)該技術(shù)至今還未發(fā)展完全，其轉(zhuǎn)基因片段較小，且相鄰基因片段高度同源，重組過(guò)程復(fù)雜，在面對(duì)抗原多樣性時(shí)，無(wú)法完全產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。4.3核糖體展示技術(shù)基本原理基本原理：利用PCR 擴(kuò)增含目的基因的cDNA 文庫(kù)，再加上啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)及莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)作用下，形成“蛋白質(zhì)-核糖體-mRNA”三元復(fù)合物，用相應(yīng)抗原反復(fù)篩選復(fù)合物，分離mRNA，通過(guò)RT-PCR 富集目的基因，并將目的基因?qū)氡磉_(dá)載體，從而獲得庫(kù)容量大、特異性強(qiáng)、親和力高的人源基因工程抗體庫(kù)。存在的問(wèn)題：存在的問(wèn)題： 1.mRNA 易降解。 2.“蛋白質(zhì)-核糖體-

7、mRNA” 三元復(fù)合物的穩(wěn)定性也較差。解決方案：解決方案： 1.目前已有研究表明，氧釩核糖核苷復(fù)合物(VRC)作為過(guò)渡階段的類似物發(fā)生作用，可有效地抑制核酸酶，提高mRNA的穩(wěn)定性。 2.在緩沖液中加入一定濃度的鎂離子、交聯(lián)核糖體RNA 的磷酸基團(tuán)，可抑制核糖體復(fù)合物的解離。1.與噬菌體展示技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，由于其完全屬于體外操作系統(tǒng)， 無(wú)需依賴細(xì)胞技術(shù)和毒性蛋白對(duì)宿主菌生長(zhǎng)的影響，不受體內(nèi)環(huán)境的限制，擴(kuò)大了展示文庫(kù)的庫(kù)容量和分子多樣性。優(yōu)越性：優(yōu)越性：3.目前還有很多研究表明，核糖體展示技術(shù)還能提高小分子抗體的穩(wěn)定性，如三結(jié)構(gòu)域抗體(VH/K)可以明顯改進(jìn)ScFv的穩(wěn)定性。2.核糖體展示

8、技術(shù)無(wú)需進(jìn)行體內(nèi)外系統(tǒng)轉(zhuǎn)化，全程只需通過(guò)PCR技術(shù)復(fù)制、擴(kuò)增，使得其建庫(kù)時(shí)間縮短，篩選簡(jiǎn)便。PCR技術(shù)還可引入突變，增加分子多樣性，從而獲得高親和力抗體。我國(guó)單克隆抗體藥物研發(fā)進(jìn)展情況我國(guó)單克隆抗體藥物研發(fā)進(jìn)展情況近年來(lái)中國(guó)的單抗技術(shù)已經(jīng)受到越來(lái)越多的關(guān)注和重視，單克隆抗體藥物研究已被列入863計(jì)劃和國(guó)家重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目計(jì)劃和國(guó)家重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目。“十二五”期間，我國(guó)“重大新重大新藥創(chuàng)制藥創(chuàng)制”專項(xiàng)專項(xiàng)，中央財(cái)政下?lián)苜Y金100億元，配套資金300億元。專項(xiàng)戰(zhàn)略重點(diǎn)包括創(chuàng)新藥物研究開發(fā)、藥物大品種技術(shù)改造等。惡性腫瘤、心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、肺結(jié)核等10類重大疾病藥物的研發(fā)是創(chuàng)制資金支持重

9、點(diǎn)。目前，中國(guó)已經(jīng)上市的抗體只有20多個(gè)（截止到2010年7月），絕大多數(shù)在臨床研究或已經(jīng)上市的品種為完全仿制國(guó)外上市的產(chǎn)品,年銷售約1億美元，生產(chǎn)水平低、規(guī)模小，制約了單抗藥物在中國(guó)的發(fā)展，我國(guó)政府和企業(yè)已經(jīng)逐漸意識(shí)到抗體藥物的安全性和有效性以及巨大的市場(chǎng)效益，在抗體新靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)、抗體大規(guī)模表達(dá)等產(chǎn)業(yè)化等方面發(fā)展迅速，投入逐漸增加，有望在510年內(nèi)達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平?！笆濉焙汀笆濉笔俏覈?guó)抗體產(chǎn)業(yè)發(fā)展的黃金期，到了“十三五”期間，目前居全球前十位的抗體藥物基本都能在我國(guó)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。 目前，我國(guó)的單克隆抗體產(chǎn)業(yè)已經(jīng)形成了以北京、上海、西安以及武漢等產(chǎn)業(yè)化基地。而單克隆抗體也發(fā)展到了第四代，我國(guó)已經(jīng)上市的單抗藥物多為鼠源性，正在研究中的多為嵌合或者人源化單抗，而全人源單抗還沒有。而在全球的單克隆抗體市場(chǎng)，全人源化單克隆抗體是其未來(lái)的發(fā)展方向。在FDA批準(zhǔn)上市的80多種基因工程和抗體工程產(chǎn)品中，抗 體類產(chǎn)品有26種，其中18種為人源化抗體。