菌種的選育與保藏

1、第三章微生物菌種選育與保藏本章知識概要第一節(jié)菌種分離與篩選第二節(jié)菌種選育第三節(jié)菌種保藏第一節(jié)菌種分離與篩選1、采樣原則：材料來源越廣泛，越有可能獲得新的菌種。可尋找已適應(yīng)各種環(huán)境壓力的微生物類群。土壤、水、空氣、動植物體都含有微生物。土壤由于具備了微生物所需要的營養(yǎng)、水分、空氣。是微生物最集中的地方從土壤中 幾乎可以分離所需要任何菌株。細(xì)菌（108） 放線菌（107） 霉菌（106） 酵母菌（105） 藻類（104） 原生動 物（103）采樣方法：選擇適當(dāng)?shù)攸c和場所、用無菌器皿取樣十克，裝入袋中，記錄采樣地點、時間、 環(huán)境等等。2、富集培養(yǎng)：在目的微生物含量較少時，根據(jù)微生物的生理特點，設(shè)計一

2、種選擇性培養(yǎng)基，創(chuàng)造 有利的生長條件，是目的微生物在最適的環(huán)境下，迅速生長繁殖，數(shù)量增加，由原來自然 條件下劣勢種變成人工環(huán)境下的優(yōu)勢種，以利于分離到所需要的菌株。A:控制營養(yǎng)條件-纖維素酶產(chǎn)生菌B:控制培養(yǎng)條件-施加壓力、pH、溫度、氧氣、根據(jù)特殊生理特征、C :添加特殊抑制劑-抗生素3、純種分離：富集培養(yǎng)而得到微生物， 并不能達(dá)到純化標(biāo)準(zhǔn)， 雜菌并沒有死亡、還需要進(jìn)一步純化- 純培養(yǎng)粗放型：菌落純精細(xì)型：菌種純劃線分離法A:粗放型涂布分離法稀釋分離法平板劃線分離法：接種針挑取含有微生物樣品，在固體培養(yǎng)基表面上劃線，適當(dāng)條件培養(yǎng)后，挑取單 菌落。稀釋分離法用1ml無菌吸管精確地吸取 1ml大

3、腸桿菌懸液放入10-1的試管中，使其混合均勻。另 取一支吸管自10-1試管吸1ml放入10-2試管中其余依次類推。涂布分離法用涂棒蘸取培養(yǎng)液，在固體培養(yǎng)基表面均勻涂平，獲得單菌落。精細(xì)型：毛細(xì)管分離法：利用培養(yǎng)皿或凹玻片等分離小室進(jìn)行細(xì)胞分離。也可以利用復(fù)雜的顯微操 作裝置進(jìn)行單細(xì)胞挑取。流式細(xì)胞儀：流式細(xì)胞儀(Flow CytoMeter, FCM )是一種在功能水平上對單細(xì)胞或其他 生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測手段，它可以高速分析上萬個細(xì)胞，并能同時從一個 細(xì)胞中測得多個參數(shù)，與傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點 ， 成為當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析和檢測、篩選技術(shù)。

4、篩選方案：4、性能鑒定：平皿快速檢測 生產(chǎn)性能測定 平皿快速檢測法 第二節(jié)優(yōu)良菌種選育 自然選育 誘變育種 一、自然選育1、自然選育：菌種在生產(chǎn)過程中不經(jīng)過人工處理，利用微生物自身堿基突變而進(jìn)行的菌種 篩選過程。多因素低劑量的誘變效應(yīng)：輻射、H2O2、02互變異構(gòu)：DNA分子的堿基，存在酮式-烯醇式或氨式-亞胺式互變異構(gòu)。不同的互變異 構(gòu)體形成氫鍵的方向和能力不同，有可能導(dǎo)致復(fù)制時出現(xiàn)錯誤。例如在正常情況下，A (氨式結(jié)構(gòu))與T (酮式結(jié)構(gòu))配對；當(dāng) A以亞胺式存在時(幾率非常小)，則與C配對。 2、誘變育種利用各種被稱為誘變劑的物理因素和化學(xué)試劑處理微生物細(xì)胞，使菌體負(fù)責(zé)遺傳作用的DNA分子

5、中的堿基對產(chǎn)生突變，進(jìn)而采用簡便、快速和高效的篩選方法，獲得所需要的高 產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的方法。誘變育種原理：基因突變?nèi)旧w畸變：染色體或 DNA片段發(fā)生缺失、易位、重復(fù)等現(xiàn)象基因突變：DNA堿基發(fā)生變化 誘變劑：物理、化學(xué)、生物三大類。(1)物理誘變劑紫外線、X-射線、丫 -射線、激光、快中子、超聲波、同位素等等紫外線誘變機(jī)制：造成 DNA鏈斷裂或是DNA分子或分子間發(fā)生交聯(lián)。核酸物質(zhì)的最大紫外線吸收峰值在 265nm波長處。(2)化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑的種類有許多，但具有高效誘變作用的并不多，常用的化學(xué)誘變劑根據(jù)其作用 方式不同分為三種類型。與核酸堿基化學(xué)反應(yīng)的誘變劑此類型主要有烷化劑、亞硝酸和羥

6、胺等。A:烷化劑，帶有一個或多個活性烷基，帶一個活性烷基稱單功能烷化劑，帶二個或多個的 分別稱為雙功能或多功能烷化劑。它們的誘變作用是其與 DNA中的堿基或磷酸作用。常見的烷化劑有硫酸二乙酯 （DES）、甲基磺酸乙酯（EMS）、亞硝基月瓜（NTG）、亞硝基甲 基月尿（NMU）、氮芥、乙烯亞胺和環(huán)氧乙酸等。B:亞硝酸-亞硝酸的作用主要是使堿基氧化脫氨基，如使腺喋吟（A）、胞喀咤（C）和鳥喋吟（G）分別脫氨基成為次黃喋吟（H）、尿喀咤（U）和黃喋吟（X）。復(fù)制時，次黃喋吟、尿喀咤和黃 喋吟分別與胞喀咤（C）、腺喋吟（A）和胞喀咤（C）配對。（2）、誘變育種的方法步驟 2.1制定篩選目標(biāo)高產(chǎn)量生長速

7、度快、產(chǎn)抱子多；消除某些色素或無益組分；能有效利用廉價的發(fā)酵原材料；改善發(fā)酵工藝中的某些缺陷 （如泡沫過多、對溫度波動敏感、菌絲太多、自溶早、過濾困 難等）。2.2制定育種方案誘變篩選的典型流程見后圖，除了增加了誘變處理，其他與前面所講的自然選育過程基本相似。菌株選育典型流程出發(fā)菌株（砂土管或冷凍管）原種特性考擦斜面或搖瓶培養(yǎng)單抱子懸液菌懸液誘變處理篩處理前后計數(shù)稀釋涂平板觀察單菌落形態(tài)挑選單菌落轉(zhuǎn)種斜面搖瓶初篩面出發(fā)菌株的選擇小試24h培養(yǎng)基優(yōu)化挑出高產(chǎn)菌株搖瓶復(fù)傳種斜面保藏菌株對照組比較挑出高產(chǎn)斜用來進(jìn)行誘變實驗的菌株就是出發(fā)菌株，對它的選擇是誘變育種工作成敗的關(guān)鍵，挑 選出發(fā)菌株有以下幾

8、點原則：a.來源于自然界直接分離的野生菌株.b.有利于發(fā)酵產(chǎn)物合成的性狀，出發(fā)菌株應(yīng)具有生產(chǎn)上所需要的代特征。c.要盡量選擇單倍體細(xì)胞、單核或核少的多細(xì)胞體來作出發(fā)誘變細(xì)胞，這是由于變異性狀 大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。d.生產(chǎn)或科研上經(jīng)過多次誘變改造的菌株。誘變劑的選擇誘變劑復(fù)合處理及其協(xié)同效應(yīng)突變株篩選誘變處理后遺傳性能發(fā)生變化：營養(yǎng)缺陷型、抗性、代、呼吸缺陷、形態(tài)變異、生長繁殖、 溫度敏感性突變株。i粗篩方法：A:菌體形態(tài)觀察法：形態(tài)與產(chǎn)量并沒有完全相關(guān)性，形態(tài)特征變化可能引起產(chǎn)量變化，阿舒假囊酵母-VB 2高產(chǎn)菌落深黃色，淺黃色、白色低產(chǎn)。B：平皿快速檢測法 a：紙片顯色法，浸有指

9、示劑濾紙。 b:變色圈法；c：透明圈法；d: 生長圈法；e：抑制圈法。ii復(fù)篩搖瓶培養(yǎng)法：a、抗反饋阻遏和抗反饋抑制突變株的篩選常用的篩選方法為：1)抗末端產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物突變株。2)利用營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變篩選抗反饋突變株。例如：谷氨酸棒桿菌的肌甘酸脫氫酶的回復(fù)突變株對其終產(chǎn)物鳥甘酸的反饋調(diào)節(jié)不敏感，從而提高了鳥甘酸的產(chǎn)量。b、抗性突變株的篩選這包括抗生素、金屬離子、溫度、噬菌體等抗性突變株的篩選。方法是在平板中(分離 培養(yǎng)基)和初篩培養(yǎng)基中加入不同的抗性物質(zhì)，能夠很好生長的菌株就為抗性突變株。選擇能和抗生素或合成中間體結(jié)合的對菌體生長有毒性作用的抑制劑，如二價金屬離子加入培養(yǎng)基中，當(dāng)抑制劑達(dá)到

10、一定濃度時，抗生素低產(chǎn)菌株不能夠生存，可以得到高產(chǎn)菌株。c、組成型突變株的篩選(1)通過加入誘導(dǎo)酶合成抑制物篩選組成酶的突變株。如鄰硝基-3 -D-巖藻糖甘抑制 3 -半乳糖甘酶的合成。(2)利用交替培養(yǎng)法使組成型突變株處于優(yōu)勢。(3)顯色法篩選組成型突變株生產(chǎn)酶。如鄰硝基苯半乳糖昔用于篩選3-半乳糖甘酶組成型突變株，剛果紅用于篩選纖維素酶組成型突變株。d、營養(yǎng)缺陷型的選育*營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變育種，出發(fā)菌株發(fā)生基因突變，致使細(xì)胞組成成分的合成途徑出 現(xiàn)某些缺陷，在只含有最低限度營養(yǎng)物質(zhì)的基本培養(yǎng)基上不能生長，必須在此中培養(yǎng)基中 加入某些有機(jī)營養(yǎng)物才能正常生長。氨基酸、維生素和堿基與營養(yǎng)缺陷

11、型對應(yīng)的是野生型。能滿足野生型菌株正常生長的培養(yǎng)基稱基本培養(yǎng)基(MM minimal medium);在基本培養(yǎng)基中有針對性地補加某一種或幾種營養(yǎng)成分，以滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株生長需要(其他營養(yǎng)缺陷型仍不能生長)的培養(yǎng)基補充培養(yǎng)基(SM supplemental medium);可滿足該菌各種營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)需要的天然或半合成培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基(CM completemedium),如牛肉高蛋白月東培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。營養(yǎng)缺陷型的用途：營養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大。目前生產(chǎn)氨基酸、核甘酸的菌種都是各種類型的缺陷型。要研究代途徑，育種技術(shù)都必須有營養(yǎng)缺陷型的菌株為材料。篩選營養(yǎng)缺

12、陷型的步驟菌種誘變淘汰野生型檢出缺陷型營養(yǎng)缺陷型的鑒定二、淘汰野生型原理：野生型能在 MM中生長，而缺陷型不能，于是將誘變處理液在 MM中培養(yǎng)短時讓野 生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于休眠狀態(tài)?？股胤ǎ河捎诩?xì)菌或酵母對一些抗生素敏感，于是就相應(yīng)加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野 生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細(xì)菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌絲過濾法：對于霉菌，因抱子生長后會長出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷型抱子卻 因未發(fā)芽而不能濾過。添加化學(xué)試劑法：青霉屬、鏈霉菌屬、芽抱桿菌屬菌株可用25-50mg/mL五氯酚處理發(fā)芽抱子。適當(dāng)亞硫酸對霉菌發(fā)芽抱子

13、有選擇殺死作用差別殺菌法：芽抱耐熱性強(qiáng)，萌發(fā)后的菌體細(xì)胞不耐熱，通過加熱殺死營養(yǎng)體細(xì)胞，芽抱保存。三、營養(yǎng)缺陷型菌株的檢出1、逐個檢出法：把經(jīng)誘變處理的細(xì)胞群涂布在完全培養(yǎng)基的瓊脂平板上，待長成單個菌落 后，用接種針或滅過菌的牙簽把這些單個菌落逐個整齊地分別接種到基本培養(yǎng)基平板和另 一完全培養(yǎng)基平板上，使兩個平板上的菌落位置嚴(yán)格對應(yīng)。經(jīng)培養(yǎng)后，如果在完全培養(yǎng)基 平板的某一部位上長出菌落，而在基本培養(yǎng)基的相應(yīng)位置上卻不長，說明此乃營養(yǎng)缺陷型。2、夾層培養(yǎng)法：先在培養(yǎng)皿底部倒一薄層不含菌的基本培養(yǎng)基，待凝，添加一層混有經(jīng)誘 變劑處理菌液的基本培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后，對首次出現(xiàn)的菌落用記號筆一一標(biāo)在皿底。

14、然后 再加一層完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)后新出現(xiàn)的小菌落多數(shù)都是營養(yǎng)缺陷型突變株。3、限量補充培養(yǎng)法：把誘變處理后的細(xì)胞接種在含有微量（V0.01%）蛋白月東的基本培養(yǎng)基平板上，野生型細(xì)胞就迅速長成較大的菌落，而營養(yǎng)缺陷型則緩慢生長成小菌落。若需 獲得某一特定營養(yǎng)缺陷型，可再在基本培養(yǎng)基中加入微量的相應(yīng)物質(zhì)。4、影印平板法：將誘變劑處理后的細(xì)胞群涂布在一完全培養(yǎng)基平板上，經(jīng)培養(yǎng)長出許多菌 落。用特殊工具-印章”把此平板上的全部菌落轉(zhuǎn)印到另一基本培養(yǎng)基平板上。經(jīng)培養(yǎng)后， 比較前后兩個平板上長出的菌落。如果發(fā)現(xiàn)在前一培養(yǎng)基平板上的某一部位長有菌落，而 在后一平板上的相應(yīng)部位卻呈空白，說明這就是一個營養(yǎng)缺陷型

15、突變株。四、營養(yǎng)缺陷型的鑒定生長譜法。生長譜法是指在混有供試菌的平板表面點加微量營養(yǎng)物，視某營養(yǎng)物的周圍有否長菌來確定該供試菌的營養(yǎng)要求的一種快速、直觀的方法。具體操作：把生長在完全培養(yǎng)液里的營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞經(jīng)離心和無菌水清洗后，配成適當(dāng)濃度的懸液（如107108個/ ml）,取0.1ml與基本培養(yǎng)基均勻混合后，傾注在培養(yǎng)皿，待凝固、表面干燥后，在皿背劃幾個區(qū)，然后在平板上按區(qū)加上微量待鑒定缺陷型所需的營養(yǎng)物粉末（濾紙片），例如氨基酸、維生素、喋吟或喀咤堿基等。經(jīng)培養(yǎng)后，如發(fā)現(xiàn)某一營養(yǎng)物的周圍有 生長圈，就說明此菌就是該營養(yǎng)物的缺陷型突變株。五、基因重組育種基因重組育種：采用結(jié)合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、原

16、生質(zhì)體融合、有性雜交及準(zhǔn)性生殖的遺傳學(xué)的 方法和技術(shù)使微生物細(xì)胞發(fā)生基因重組，增加優(yōu)良性狀的組合或者導(dǎo)致多倍體的出現(xiàn)，從 而獲得優(yōu)良菌株的一種育種方法。(一)原核生物的基因重組育種：1、結(jié)合供體菌通過性菌毛與受體菌直接接觸，把F質(zhì)?；蚱鋽y帶的不同長度的核基因組片段傳遞給后者，使后者獲得若干新遺傳性狀的現(xiàn)象。大腸桿菌中存著致育因子 F,有F因子為F+ ,沒有F因子稱F-oF因子存在于細(xì)胞中形式：游離狀態(tài)(F+細(xì)胞)；整合狀態(tài)，即F因子插入胞核質(zhì)的一定位置上(Hfr細(xì)胞)。F因子有明顯的感染性，大腸桿菌的接合，實質(zhì)上是F因子的轉(zhuǎn)移，所以 F+和Hfr稱供體菌，而F-稱受體菌。2、轉(zhuǎn)導(dǎo)通過轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體

17、的媒介，把供體細(xì)胞的DNA片段攜帶到受體細(xì)胞中，從而使后者獲得前者 部分遺傳性狀的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)導(dǎo)子轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)3、轉(zhuǎn)化受體菌直接吸收供體菌的 DNA片段而獲得了供體菌部分遺傳性狀的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化子感受態(tài)：遺傳性、菌齡、生理狀態(tài)、培養(yǎng)條件CaCl 2冰冷 電擊(二)放線菌的雜交育種基因重組過程近似于細(xì)菌，但其育種方法有許多與霉菌相似。1、雜交原理放線菌基本上有四種遺傳體系。(1)異核現(xiàn)象有些放線菌的營養(yǎng)缺陷型在混合培養(yǎng)或雜交過程中，經(jīng)菌絲之間的接觸和融合而形 成異核體。異核體形成的菌落在表型上是原養(yǎng)型的，無重組體出現(xiàn)。(2)結(jié)合現(xiàn)象不同基因型的細(xì)胞核在雙方增殖過程中，發(fā)生部分DNA的轉(zhuǎn)

18、移或遺傳信息的交換，形成部分合子。(3)異核系的形成當(dāng)部分合子形成后，經(jīng)過一次單交換而產(chǎn)生異核系染色體組。(4)重組體的形成異核系不穩(wěn)定，在菌落生長過程中，在染色體重疊區(qū)域不同的部位再次發(fā)生交換后， 能產(chǎn)生重組體抱子。也可由部分合子不經(jīng)過異核系，直接經(jīng)過雙交換形成重組抱子。2雜交方法(1)混合培養(yǎng)法：要求兩親本菌株必須為互補的營養(yǎng)缺陷型。將兩菌株接種到完全培養(yǎng) 基上培養(yǎng)至抱子長出，然后將抱子在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，能長出的菌株為重組菌株。(2)平板雜交法：將菌株一在完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)至產(chǎn)生抱子，用影印法將菌落抱子印至已 鋪有另一菌株抱子的完全培養(yǎng)基上，等長出抱子后，用基本培養(yǎng)基篩選重組菌株。、霉

19、菌的雜交育種構(gòu)巢曲霉-準(zhǔn)性雜交不經(jīng)過減數(shù)分裂就能導(dǎo)致基因重組的生殖過程四、酵母菌的雜交育種性細(xì)胞間的結(jié)合和隨之發(fā)生的染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代的一種育種技術(shù)。子囊抱子的形成子囊抱子的分離雜種的獲得（三）原生質(zhì)體融合分別酶解兩個不同遺傳性狀的菌株細(xì)胞壁，在高滲環(huán)境中釋放出只有原生質(zhì)體膜包被的原生質(zhì)體，將它們混合，然后通過物理、化學(xué)或生物學(xué)方法使他們互相聚集，通過遺傳性狀不同的兩親本原生質(zhì)體融合，接著發(fā)生染色體交換、重組而達(dá)到雜交目的。并篩選獲得集雙親優(yōu)良性狀于一體的穩(wěn)定重組體。六、基因工程育種基因工程：用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)DNA分子提取出來，在離體條件下進(jìn)行切割，獲得

20、代表某一性狀的目的基因，把該目的基因與作為載體的DNA分子連接起來，然后導(dǎo)入某一受體細(xì)胞中，讓外源基因在受體細(xì)胞中進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從 而獲得目的產(chǎn)物。一個完整的基因克隆過程包括以下步驟1、獲得待克隆的 DNA片段（基因）；2、目的基因與載體在體外連接；3、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞；4、篩選、鑒定陽性重組子；5、表達(dá)篩選。（一）載體系統(tǒng)：攜帶目的基因并將其轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的運載工具。1、特征：一般為環(huán)狀，具有體外酶切和連接能力，與目的基因結(jié)合成環(huán)狀-轉(zhuǎn)化-受體細(xì)胞中-復(fù)制表達(dá)能力2、載體具備性質(zhì)：在宿主細(xì)胞具有自主復(fù)制和表達(dá)能力。能與外源DNA片段結(jié)合而不影響本身的復(fù)制能力

21、。具有兩個以上限制性切酶單一位點。具有兩個易檢測的遺傳標(biāo)記，賦予宿主細(xì)胞不同的表型，便于檢測和分離。載體分子量盡可能小，便于與較大基因結(jié)合，不易受到機(jī)械剪切。易于轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞。3、常用質(zhì)粒載體pBR322質(zhì)粒載體pplasmidBR 構(gòu)建者 Boliver 和 Rodriguez322實驗標(biāo)號pUC質(zhì)粒載體Plasmid University California宿主：JM101細(xì)菌細(xì)胞（突變體）限制性核酸切酶（限制酶）限制性核酸切酶（restriction endonuclease, RE）是識別DNA的特異序列（48bp）,并在 識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類切酶。（四）目的基因的

22、獲取1、通過建立基因文庫分離靶基因2、化學(xué)合成法制備 DNA片段從蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸順序可以知道它的遺傳密碼，再依照密碼合成基因。3、聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增基因片段對于已知全部或部分核甘酸序列的基因，可以通過聚合酶鏈反應(yīng)（ PCR）,以基因組DNA 或cDNA模板擴(kuò)增得到目的基因片段。（五）重組DNA導(dǎo)入宿主菌體外連接的重組DNA分子必須導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中才能大量的復(fù)制、增殖和表達(dá)。根據(jù)所采用的載體的性質(zhì)，將重組DNA分子導(dǎo)入受體可有不同的方法。1、轉(zhuǎn)化指以細(xì)菌質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)化時，細(xì)菌必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)?處理使之處于感受態(tài)-即容易接受外源DNA的狀態(tài)，然后利用短暫熱休克

23、使 DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主中。此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細(xì)菌，它的優(yōu)點是操作簡便、轉(zhuǎn)化效率高、適用于任何菌株。2、轉(zhuǎn)染和感染利用噬菌體DNA作為載體時可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌。一種是感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。另一種方式是轉(zhuǎn)染，即在 DNA連接酶作用下使噬菌體 DNA環(huán)化，再象重組質(zhì)粒一樣地 轉(zhuǎn)化進(jìn)受體菌。但習(xí)慣上常把以噬菌體 DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細(xì)胞的過程統(tǒng)稱為 轉(zhuǎn)染。（六）重組克隆的篩選與鑒定基因克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選出含有陽性重組子的菌落，并鑒定重組子的 正確性。通過細(xì)菌培養(yǎng)以及重組子的擴(kuò)增，獲得所需的基因片段的大量拷貝。進(jìn)一步研究該基因

24、的 結(jié)構(gòu)、功能，或表達(dá)該基因的產(chǎn)物。種子制備將保存在沙土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面，活化后再經(jīng)過扁瓶、搖瓶及種子罐逐級擴(kuò)大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種培養(yǎng)過程。工業(yè)發(fā)酵種子的制備種子質(zhì)量的控制發(fā)酵階段的條件控制一、 概述（一）種子擴(kuò)大的目的 31、為每次發(fā)酵罐投料提供一定數(shù)量代旺盛的種子2、有利于縮短發(fā)酵時間、提高罐利用率。3、減少雜菌污染機(jī)會（二）優(yōu)良種子必須具備條件1、菌種細(xì)胞生長活力強(qiáng)，接種于發(fā)酵罐后迅速生長，延遲期短。2、生理狀態(tài)穩(wěn)定，以得到穩(wěn)定的菌體生長過程。3、具有適宜的菌體總量及濃度，滿足大容量發(fā)酵需要。4、無雜菌及噬菌體污染，保證整個發(fā)酵正常進(jìn)行。5、

25、保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力，使最終產(chǎn)物高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)。（三）種子擴(kuò)大培養(yǎng)的工藝流程將砂土管或冷凍抱子接種到斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)；將斜面抱子或菌絲體轉(zhuǎn)接到扁瓶固體培養(yǎng)基或搖瓶液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，制備實驗室種子；將擴(kuò)大培養(yǎng)的抱子或菌絲體按種到一級種子罐，制備生產(chǎn)用種子，一級種子再接種至二級種子罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，完成生產(chǎn)車間種子的制備；制備好的生產(chǎn)種子轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。（四）種子進(jìn)罐的方法：1、抱子進(jìn)罐法：先在固體培養(yǎng)基上生長、繁殖成大量抱子，將抱子直接接入種子罐擴(kuò)大培 養(yǎng)。發(fā)酵生產(chǎn)方向，細(xì)、霉、放線菌采用，工藝簡單、種子易于保存、減少污染機(jī)會，沙土 管冷凍管用量較大。2、菌絲搖瓶進(jìn)罐法：將固

26、體培養(yǎng)基上繁殖的抱子接入搖瓶液體培養(yǎng)基中，使菌絲生長，再 將搖瓶菌絲接入種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵。生長、發(fā)育緩慢放線菌、節(jié)約沙土管冷凍管用量， 菌絲不易保存，批次之間差異大，污染機(jī)會多。二、工業(yè)發(fā)酵種子的制備實驗室種子制備：抱子制備、固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)、搖瓶液體培養(yǎng)。生產(chǎn)車間種子制備：搖瓶液體種子制備、種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)（一）實驗室種子制備抱子制備-發(fā)酵工序開端1、放線菌抱子制備：培養(yǎng)基一般采用瓊脂和其他一些適合抱子生長的成分?？钇ぁ⑼愣菇?、蛋白月東、牛肉膏和一些無機(jī)鹽等， 其中的碳源和氮源不要太豐富 （碳源約為1%,氮源不超過0.5%）。碳 氮比例大一些為好， 這樣避免菌絲的大量形成，有利于產(chǎn)生大

27、量抱子。一般情況下，干燥和限制營養(yǎng)可直接或間接誘導(dǎo)。2、霉菌抱子制備：培養(yǎng)基一般使用大米、小米、玉米、麥秋等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基原料。適合霉菌的生 長繁殖、這類培養(yǎng)基的表面積較大，可獲得大量的抱子。制備大（?。┟着囵B(yǎng)基，要嚴(yán)格控制滅菌后培養(yǎng)基的含水量，使其不粘不散。接種時，先將砂土管或冷凍管中的菌種制成懸浮液，再把一定量的懸浮液直接接人大（?。┟着囵B(yǎng)基上，培養(yǎng)成熟后稱為 親米”，由親米再轉(zhuǎn)至大（?。┟着囵B(yǎng)基上，培養(yǎng)成熟后稱為 生產(chǎn)米”。 用 生產(chǎn)米”制成抱子懸浮液，最后轉(zhuǎn)入種子罐。培養(yǎng)溫度2528C, 一般培養(yǎng)時間 414天。3、細(xì)菌類抱子制備制備細(xì)菌類抱子，斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的

28、配方。牛肉膏，蛋白陳 是常用的有機(jī)氮源。細(xì)菌培養(yǎng)溫度大多數(shù)為37 C,少數(shù)為28 Co細(xì)菌菌體培養(yǎng)時間一般為12d,產(chǎn)芽抱的細(xì)菌則需培養(yǎng) 910d。搖瓶液體種子制備 種子罐種子制備 1、搖瓶液體種子制備某些抱子發(fā)芽和菌絲繁殖速度緩慢的菌種，需要將抱子經(jīng)搖瓶液體培養(yǎng)成菌絲后再接 人種子罐，這就是搖瓶種子。將斜面抱子接種到體積較小的搖瓶（母瓶）中，經(jīng)培養(yǎng)后形成大量菌絲體后，再轉(zhuǎn)接 到較大的搖瓶（子瓶）中培養(yǎng)，這種搖瓶培養(yǎng)方法稱為母瓶-子瓶兩級培養(yǎng)、搖瓶進(jìn)罐法常采用 母瓶-子瓶兩級培養(yǎng)。2、種子罐種子制備種子罐的級數(shù)是指制備種子需要逐級擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)。種子罐種子制備的工藝過程， 因菌種不同而有差異，

29、一般可分為一級種子、二級種子和三級種子的制備。抱子（或搖瓶菌絲）被接種到體積較小的種子罐中，經(jīng)培養(yǎng)后形成大量的菌絲，這樣的 種子稱為一級種子。把一級種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐發(fā)酵，稱為二級發(fā)酵。如果將一級種子接入到體積較大的種子罐中，經(jīng)培養(yǎng)后形成更多的菌絲，這樣的種子稱為二級種子。把二級種子轉(zhuǎn)入 發(fā)酵罐發(fā)酵，稱為三級發(fā)酵。一般應(yīng)根據(jù)菌種生長特性、抱子發(fā)芽和繁殖速度以及所采用的發(fā)酵罐容積來確定種子 罐的級數(shù).抗生素生產(chǎn)中，放線菌的細(xì)胞生長繁殖速度較慢，常采用二級種子擴(kuò)大培養(yǎng)，即三級發(fā)酵，一般50t發(fā)酵罐多采用三級發(fā)酵，有的甚至采用四級發(fā)酵。谷氨酸類氨基酸發(fā)酵所采用的菌種是細(xì)菌，生長繁殖速度很快，采用二級發(fā)酵

30、。種子異常的分析1、菌種生長發(fā)育緩慢或過快這種現(xiàn)象是指在各項工藝參數(shù)正常的情況下，出現(xiàn)整個代過程過慢或過快。菌種在種 子罐中生長發(fā)育緩慢或過快和抱子質(zhì)量以及種子罐的培養(yǎng)條件有關(guān)。一般情況下，通入種子罐中無菌空氣的溫度較低或者培養(yǎng)基的滅菌質(zhì)量較差是種子生長、代緩慢的主要原因。3、菌絲貼壁所謂菌絲粘壁是指在種子培養(yǎng)過程中.菌絲正常發(fā)育生長，但再繼續(xù)培養(yǎng)時菌絲逐步粘附在罐壁上。當(dāng)菌絲繁殖速度低于被罐壁粘附的速度時，培養(yǎng)液中菌絲濃度愈來愈小，最后就可能形成菌絲團(tuán)。攪拌效果不好攪拌時泡洙過多以及種子罐裝料系數(shù)過小等原因造成。在以真菌為產(chǎn)生菌的種子培養(yǎng)過程中，發(fā)生菌絲貼壁的機(jī)會較多。4、生理生化代異常如糖

31、、氮代過快或過慢，pH過高或過低，種子罐發(fā)酵單位低等。第四節(jié)菌種保藏和復(fù)壯一、菌種退化：生產(chǎn)菌株遺傳標(biāo)記的丟失及生產(chǎn)能力的下降退化表現(xiàn)：產(chǎn)量下降，騰倉赤霉產(chǎn)赤霉素能力下降。菌落和細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，云金芽抱桿菌一芽抱伴抱晶體變小而少。對宿主寄生能力下降，白僵菌對宿主致病能力下降。退化原因：基因突變，控制細(xì)胞性狀的基因發(fā)生突變當(dāng)控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負(fù)突變，就會引起產(chǎn)量下降；當(dāng)控制抱子生成的基因發(fā)生負(fù)突變，則使菌種產(chǎn)抱子性能下降。分離現(xiàn)象遺傳育種獲得菌株如果是多核的細(xì)胞或菌絲體，基因突變只發(fā)生在一個核上，在傳代過 程中會發(fā)生分離現(xiàn)象。退化防止：盡可能使用單核菌株或抱子，避免對多核細(xì)胞處理，誘變后要進(jìn)行充分的篩選?？刂苽鞔螖?shù)，隨著傳代次數(shù)的增加，退化現(xiàn)象增加。創(chuàng)造良好的培養(yǎng)環(huán)境，適合微生物的培養(yǎng)。采用有效的菌種保藏方法。二、菌種的保藏（一）目的使微生物菌種保持原來的性狀和活力不退化、不死亡、不被污染，便于研究、交換和使用。（二）原理挑選典型培養(yǎng)物（typical culture ）的優(yōu)良純種，并創(chuàng)造最有利于休眠的環(huán)境條件，使微生物處于代不活潑、生長受抑制的休眠狀態(tài)。措施? 低溫：生長溫度低限約為 -30 C,水溶液中酶促反應(yīng)溫度低限-140 C? 干燥?