第16章高效液相色譜法

1、第 16 章高效液相色譜法【16-1 】 從分類原理、儀器構(gòu)造及應(yīng)用范圍，簡述氣相色譜及液相色譜的異同點(diǎn)。 答：二者都是根據(jù)樣品組分與流動相和固定相相互作用力的差別進(jìn)行分離的。 從儀器構(gòu)造上看，液相色譜需要增加高壓泵以提高流動相的流動速度，克服阻力。同時(shí)液相色譜所 采用的固定相種類要比氣相色譜豐富的多，分離方式也比較多樣。氣相色譜的檢測器主要采用熱導(dǎo) 檢測器、氫焰檢測器和火焰光度檢測器等。而液相色譜則多使用紫外檢測器、熒光檢測器及電化學(xué) 檢測器等。但是二者均可與MS等聯(lián)用。二者均具分離能力高、靈敏度高、分析速度快，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)難以用氣相色譜進(jìn)行分析。而只要

2、試樣能夠制成溶液，既可用于HPLC分析，而不受沸點(diǎn)高、熱穩(wěn)定性差、相對分子量大的限制?！?6-2 】 高效液相色譜儀由幾大部分構(gòu)成？各部分的主要功能是什么？ 答：高效液相色譜儀由高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)，檢測系統(tǒng)和記錄系統(tǒng)五大部分組成。 高壓輸液系統(tǒng)：主要是通過高壓輸液泵將溶劑儲存器中的流動相以高壓形式連續(xù)不斷地送入液路系 統(tǒng)，使試樣在色譜柱中完成分離過程。進(jìn)樣系統(tǒng)：把分析試樣有效地送入色譜柱中進(jìn)行分離。 分離系統(tǒng)：將試樣各組分分離開來。檢測系統(tǒng)：對被分離組分的物理或物化特性有響應(yīng)；對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)。 記錄系統(tǒng)：記錄被分離組分隨時(shí)間變化的信號?！?6-3 】 液相

3、色譜中影響色譜峰展寬的因素有哪些 ? 與氣相色譜相比其主要區(qū)別何在？ 答：液相色譜中引起色譜峰擴(kuò)展的主要因素為渦流擴(kuò)散、流動的流動相傳質(zhì)、滯留的流動相傳質(zhì)以 及柱外效應(yīng)。在氣相色譜中徑向擴(kuò)散往往比較顯著，而液相色譜中徑向擴(kuò)散的影響較弱，往往可以忽略。另外，在液相色譜中還存在比較顯著的滯留流動相傳質(zhì)及柱外效應(yīng)?！?6-4 】 何謂化學(xué)鍵合相色譜、正相色譜和反相色譜？ 答：化學(xué)鍵合相色譜是指在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行物質(zhì)分離的一種液相色譜法。 正相色譜是采用極性鍵和固定相流的相用比鍵合相極性小的非極性或弱極性有機(jī)溶劑。 反相色譜采用非極性鍵和固定相流的相為強(qiáng)極性的溶劑。【 16-5 】 何謂化學(xué)鍵合固

4、定相？它的突出優(yōu)點(diǎn)是什么？ 答：利用化學(xué)反應(yīng)將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體表面形成的固定相稱為化學(xué)鍵合固定相。優(yōu)點(diǎn) : 固定相表面沒有液坑 , 比一般液體固定相傳質(zhì)快的多； 無固定相流失 , 增加了色譜柱的穩(wěn)定性 及壽命； 可以鍵合不同的官能團(tuán) ,能靈活地改變選擇性 , 可應(yīng)用與多種色譜類型及樣品的分析； 利于梯度洗提 , 也有利于配用靈敏的檢測器和餾分的收集。16-6 】 什么叫梯度洗脫？它與氣相色譜中的程序升溫有何異同？答：梯度洗脫是指將兩種或兩種以上不同極性但可互溶的溶劑， 隨著時(shí)間的改變而按一定比例混合。 以連續(xù)改變色譜柱中淋洗液的極性，離子強(qiáng)度或pH 等，從而改變被測組分的相對保留值、提

5、高分離效率、加快分離速度的一種洗脫方式。液相色譜中梯度淋洗和氣象色譜中程序升溫作用相同。不同 的是：在起訴相色譜中通過改變溫度條件，達(dá)到高效快速分離目的；而液相色譜是通過 改變流動相 極性來達(dá)到目的?！?6-7 】 指出下列各種色譜法中最適宜分離物質(zhì)。（1）氣液色譜；（2）正相色譜；（3）反相色譜；（4）離子交換色譜； （5）凝膠色譜；（6）氣固色譜；（7）液固色譜。答：（ 1）氣液色譜：適宜分離氣體或易揮發(fā)性液體和固體。（或可轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)性液體和固體。 ）（2）正相色譜：適宜分離極性化合物。（3）反相色譜：適宜分離多環(huán)芳烴等低極性化合物。（4）離子交換色譜：適宜分離離子型和可離解化合物。（

6、5）凝膠色譜：適宜分離大分子化合物， （分子量 2000） 例蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等生物大 分子。（6）氣固色譜：適宜分離永久性氣體及烴類化合物。（7）液固色譜：適宜分離不同極性的化合物，或不同類型的化合物，特別適合分離異構(gòu)體【16-8 】 指出下列化合物被液體流動相從氧化鋁柱中洗脫的峰序：正丁醇、 1-丁基氯、正己 酸、正己烷、 2- 己烯。答：正己烷， 2-己烯， 1-丁基氯，正丁醇，正己酸?！?6-9 】 指出下列化合物從氧化鈣柱中流出的順序：正丁醇、甲醇、正己醇、乙醇。 答：甲醇，乙醇，正丁醇，正己醇?！?6-10 】 指出下列物質(zhì)在正相色譜中的洗脫順序。（1）正己烷，正己醇，苯；（2

7、）乙酸乙酯，乙醚，硝基丁烷。答：（ 1）正己烷，苯，正己醇 （ 2）乙醚，硝基丁烷，乙酸乙酯【 16-11 】 指出習(xí)題 10 中物質(zhì)在反相色譜中的洗脫順序。答：（ 1）正己醇，苯，正己烷 （ 2）乙酸乙酯，硝基丁烷，乙醚【16-12 】 指出下列離子從陰離子交換柱中流出的順序：Cl-，I-，F(xiàn)-，Br-。答：F-, Cl-, Br-, I -。【16-13】預(yù)測下列離子從陽離子交換柱中流出的可能順序：Ca2+, Bsf+, Mg+, Be2+, Sr2+。答：Be ， Mg , Ca，Sr ， Ba?！?6-14】 相對分子質(zhì)量約為 120000的蛋白質(zhì)在1根排阻極限為80000的凝膠柱上的

8、保留體 積為15mL萘(MW128在同1根柱上的保留體積為 124mL某特定試樣組分的保留體積為 87mL。 假定萘的相對分子質(zhì)量小于凝膠的滲透極限，計(jì)算總孔容積和試樣組分的分配系數(shù)。答：109mL 0.66【16-15】 用1根以二甲基甲酰胺作為流動相的排阻色譜柱檢測聚氧化乙烯的保留體積，試?yán)帽碇薪Y(jié)果估計(jì)保留體積為13.5mL的聚氧化乙烯聚合物的相對分子質(zhì)量。相對分子質(zhì)量V/mL相對分子質(zhì)量V/mL31.1 x 1017.247.7 X 1014.135.1 X 1016.357.0 X 1012.742.0 X 1015.1解：以相對分子量 Mr取對數(shù)logMr作為縱坐標(biāo)以保留體積 V為

9、橫坐標(biāo)，求出斜率 Klg5.1 103- lg1.1 104(16.3-17.2) K1K10.744lg7.7 104- lg2.0 104(14.1-4.3)K2K2 0.57KK -0.6572保留體積為13.5mL的相對分子質(zhì)量lg7.0 105- lg Mr-0.657(12.7-13.5)5解得 Mr 2.110【16-16】 為了解決下列分析課題，可否采用色譜法(應(yīng)指出其具體的方法名稱)？若不能采用，應(yīng)當(dāng)用哪些方法較為合理？(1) 液體中的烯烴、炔烴和芳烴三族物質(zhì)的分類和分析；(2) 水溶液中甲酸、乙酸、丙酸和丁酸的總酸度的測定；(3) 甲酸、乙酸、丙酸和丁酸混合物中含量的分別測

10、定；(4) 某工廠臨時(shí)購得一批乙醇原料，其中含丙酮約為5%10%要求比較準(zhǔn)確測出原料中丙酮的含量；(5) 混合物中對、間、鄰二甲苯含量的分別測定；(6) 鑒定某一商品高聚物；(7) 生物化學(xué)制品，如蛋白質(zhì)、膽汁酸的分類分析；(8) 空氣中氟化氫、二氧化硫氣體的分析；(9) 氯化鉀和氯化鈉水溶液中兩種正離子含量的分別測定；(10) 鋼鐵中為了 Nb、6 Hz的測定?！?6-17】 欲測定下列試樣，采用哪種色譜法較為適宜？并指出所選用的固定相、流動相和檢 測器。(1)(蒽)和(菲)；(2) CHCHOH和 CHCHCHOH2+2+(3) Ba 和 Sr ；(4) C4H9COO和 C5H11COO

11、H(5) 高相對分子質(zhì)量的葡糖苷；(6) 苯和丁酮；(7) 丁酮和乙醇；(8) 正己烷、正庚烷、正辛烷和正癸烷;(9) 分析苯中微量水分；(10) 苯乙酮、苯、硝基苯;(11)(12)HHCOOC2H5(13) F-、Cl-、Br-、NO-；(14)乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸;(17 )鄰二甲苯、間二甲苯和對二甲苯。解：部分答案如下表:題號方法名稱固定相流動相檢測器(6)氣相色譜高分子多孔微球氫氣熱導(dǎo)池檢測器(7)氣相色譜QF-1氮?dú)鈿浠鹧骐x子化檢測器(8)氣相色譜SE-30氮?dú)鈿浠鹧骐x子化檢測器(9)氣相色譜高分子多孔微球氫氣熱導(dǎo)池檢測器(10)氣相色譜鄰苯二甲酸二

12、壬酯氮?dú)鈿浠鹧骐x子化檢測器(11)反相液-液色譜ODS-permaphase甲醇/水紫外檢測器(12)液固吸附色譜法多孔硅膠甲醇/正己烷紫外檢測器(13)離子交換色譜離子交換樹脂緩沖液電導(dǎo)檢測器(14)氣相色譜法硅油(SF-1000)氮?dú)鈿浠鹧骐x子化檢測器(15)液固吸附色譜法Al 2QCHCI2/正己烷紫外檢測器(16)氣相色譜法分子篩氦氣熱導(dǎo)池檢測器(17)氣相色譜法鄰苯二甲酸二壬酯氫氣熱導(dǎo)池檢測器【16-18】電滲流是如何產(chǎn)生的？討論電滲流在毛細(xì)管電泳分類中的意義。答：電滲現(xiàn)象中整體移動著的液體稱為電滲流。HPCE通常使用石英作為毛細(xì)管材料，石英的等電點(diǎn)約為1.5，因此在常用緩沖溶液中（

13、pH 3），管壁帶負(fù)電，石英毛細(xì)管表面的硅羥基（三SiOH） 電離為硅氧基負(fù)離子（=SiO -），并將溶液中水合離子（一般為陽離子）吸附到毛細(xì)管表面附近，形成 雙電層。當(dāng)在毛細(xì)管兩端加電壓時(shí)，雙電層中的陽離子向陰極移動，由于離子是溶劑化的，所以帶 動了毛細(xì)管中整體溶液向陰極移動，形成電滲流（EOF）。電滲流在電泳分離過程中的有重要意義。體現(xiàn)在：使混合物中的正、負(fù)離子和中性分子產(chǎn)生差速 遷移而實(shí)現(xiàn)分離；通過 EOF的大小和方向的控制，可以提高CE的分離效率、選擇性和分離度。16-19 】 毛細(xì)管電泳有哪些主要分離模式？答：（1）毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE將待分析溶液引入毛細(xì)管進(jìn)樣一端，施加直流電壓后

14、，各組分 按各自的電泳流和電滲流的矢量和流向毛細(xì)管出口端，按陽離子、中性粒子和陰離子及其電荷大小 的順序通過檢測器。中性組分彼此不能分離。出峰時(shí)間稱為遷移時(shí)間（tm），相當(dāng)于高效液相色譜和氣相色譜中的保留時(shí)間。（2）毛細(xì)管凝膠電泳（CGE在毛細(xì)管中裝入單體和引發(fā)劑引發(fā)聚合反應(yīng)生成凝膠，這種方法 主要用于分析蛋白質(zhì)、 DNA等生物大分子。另外還可以利用聚合物溶液，如葡聚糖等的篩分作用進(jìn) 行分析，稱為毛細(xì)管無膠篩分。有時(shí)將它們統(tǒng)稱為毛細(xì)管篩分電泳，下分為凝膠電泳和無膠篩分兩 類。（3）毛細(xì)管等速電泳（CITP）采用前導(dǎo)電解質(zhì)和尾隨電解質(zhì)，在毛細(xì)管中充入前導(dǎo)電解質(zhì)后， 進(jìn)樣，電極槽中換用尾隨電解質(zhì)進(jìn)

15、行電泳分析，帶不同電荷的組分遷移至各個(gè)狹窄的區(qū)帶，然后依 次通過檢測器。（4） 毛細(xì)管等電聚焦電泳（CIEF）將毛細(xì)管內(nèi)壁涂覆聚合物減小電滲流，再將樣品和兩性電解 質(zhì)混合進(jìn)樣，兩個(gè)電極槽中分別加入酸液和堿液，施加電壓后毛細(xì)管中的操作電解質(zhì)溶液逐漸形成pH梯度，各溶質(zhì)在毛細(xì)管中遷移至各自等電點(diǎn)（pl ）時(shí)變?yōu)橹行孕纬删劢沟膮^(qū)帶，而后用壓力或改變檢測器末端電極槽儲液的pH值的辦法使溶質(zhì)通過檢測器。（5）膠束電動毛細(xì)管色譜（MEKC或MECC當(dāng)操作緩沖液中加入大于其臨界膠束濃度的離子型 表面活性劑時(shí)表面活性劑就聚集形成膠束，其親水端朝外憎水非極性核朝內(nèi)，溶質(zhì)則在水和膠束兩 相間分配，各溶質(zhì)因分配系數(shù)

16、存在差別而被分離。 。（6）毛細(xì)管電色譜（CEC將細(xì)粒徑固定相填充到毛細(xì)管中或在毛細(xì)管內(nèi)壁涂覆固定相以電滲 流驅(qū)動操作緩沖液（有時(shí)再加輔助壓力 進(jìn)行分離。【16-20 】 試比較毛細(xì)管電泳與高效液相色譜方法。高效毛細(xì)管電泳儀（ HPCE 是以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，利用荷電粒子 之間的淌度差異和分配系數(shù)差異進(jìn)行分離，是分析科學(xué)繼高效液相色譜儀（HPLC 之后的又一重大進(jìn)展，使分析科學(xué)從微升級進(jìn)入到了納升級水平，不僅使單細(xì)胞乃至單分子分析成為可能，也使蛋 白質(zhì)和核酸等生物大分子分析有了新的轉(zhuǎn)機(jī)。HPCE與HPLC比較如下：一、相同點(diǎn)：1、檢測器：HPCE和HPLC均可采用紫外檢

17、測器、熒光檢測器和電化學(xué)檢測器等。但由于HPCE采用在柱檢測，光路短，靈敏度和線性范圍都不如HPLC。2、定性和定量方法： HPCE勺定性和定量方法與 HPLC相同，采用出峰時(shí)間定性，峰面積或峰高3、柱效和分辨率： HPCE的柱效和分辨率計(jì)算方法與HPLC相同。二、不同點(diǎn)：1、分離原理：(1) HPCE基于組分在載體電解質(zhì)中遷移速度的不同。(2) HPLC基于組分在固定相和流動相之間分配系數(shù)的不同。2、分離模式：(1) HPCE毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管膠束電動色譜、毛細(xì)管凝膠電泳、毛細(xì)管等電聚焦電泳和 毛細(xì)管等速電泳等。(2) HPLC正相色譜、反相色譜、離子交換色譜和凝膠色譜等。3、分離柱( 1) HPCE 小內(nèi)徑毛細(xì)管柱內(nèi)裝不同載體電解質(zhì)。( 2) HPLC 小內(nèi)徑毛細(xì)管柱內(nèi)裝不同固定相。4、進(jìn)樣方式( 1) HPCE 電動進(jìn)樣、壓力進(jìn)樣和擴(kuò)散進(jìn)樣。( 2) HPLC 微量注射器進(jìn)樣、六通閥進(jìn)樣和自動進(jìn)樣器進(jìn)樣。5、進(jìn)樣體積( 1 ) HPCE 納升級。( 2) HPLC 微升級。6、溶質(zhì)驅(qū)動方式( 1 ) HPCE 以高壓直流電場為驅(qū)動力。( 2) HPLC 以高壓輸液泵驅(qū)動流動相。7、采