CD34CD59在陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿中的表達(dá)及意義

1、CD34、CD59在陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿中的表達(dá)及意義 作者：王學(xué)霞 孫建榮 高娜 于文征 張化道 【摘要】 目的 研究陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)患者骨髓CD34+細(xì)胞比率及外周血粒、紅細(xì)胞CD59表達(dá)陽(yáng)性率并探討其臨床意義。方法 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)20例PNH患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)中CD34+細(xì)胞比率及外周血中粒、紅細(xì)胞CD59表達(dá)陽(yáng)性率。 結(jié)果 PNH患者CD34+細(xì)胞比率顯著低于正常人(P<0.01);其中增生減低組CD34+細(xì)胞比率低于增生活躍、增生明顯活躍組(P均<0.05)，而后兩組之間差異無(wú)顯著性(P>0.05)。正常人

2、外周血粒、紅細(xì)胞CD59表達(dá)陽(yáng)性率均>95%，其中粒細(xì)胞CD59表達(dá)穩(wěn)定性較好;PNH患者外周血粒、紅細(xì)胞CD59表達(dá)陽(yáng)性率與正常對(duì)照組相比均顯著減低(P<0.01);粒細(xì)胞CD59在不發(fā)、偶發(fā)、頻發(fā)組中表達(dá)逐漸減低且差異均有顯著性(P<0.05)，紅細(xì)胞CD59表達(dá)則在三組之間差異無(wú)顯著性(P>0.05)。 結(jié)論 CD34+造血干細(xì)胞減少可能參與PNH發(fā)病;外周血粒、紅細(xì)胞CD59檢測(cè)是診斷PNH的特異性及敏感性方法，其中粒細(xì)胞CD59缺失程度對(duì)判斷病情嚴(yán)重與否具參考價(jià)值。 【關(guān)鍵詞】 陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿;CD34;CD59;流式細(xì)

3、胞術(shù) 【Abstract】 Objective To study the bone marrow CD34+ cell ratio and positive expression of CD59 on granulocytes and erythrocytes from peripheral blood in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria(PNH) and to explore their clinical significance.Methods The ratio of CD34+ cell in bone marrow

4、 mononuclear cells(BMMNC) and expression of CD59 on peripheral granulocytes and erythrocytes in 20 patients with PNH were detected by flow cytometry along with labelled CD34 and CD59 monoclonal antibodies.Results The ratio of CD34+ cell in PNH patients was significantly lower than that in control gr

5、oup (P<0.01). There was a significant difference between hypocellular PNH and normo/hypercellular PNH(P<0.05)，but no difference was found between the two latter groups(P>0.05). The positive expression ratio of CD59 on peripheral granulocytes and erythrocytes in control group wer

6、e all more than 95% and the former had a better stability.The expression of CD59 on both granulocytes and erythrocytes in PNH patients remarkably decreased as compared with that in control group (P<0.01 ).There was a significant difference of the expression of CD59 on peripheral granulocytes

7、among the frequent，occasional and no hemoglobinuria group(P<0.05) while there was no significant difference of the expression of CD59 on erythrocytes among the three groups (P>0.05).Conclusion The reduction of CD34+ hematopoietic stem cells may be involved in the pathogenesis of PNH. D

8、etection of CD59 on granulocytes and erythrocytes from peripheral blood could be considered as a specific and sensitive method for the diagnosis of PNH. The deficiency of CD59 on granulocytes is related to the severity of disease. 【Key words】 paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，CD34，CD59，flow cytome

9、try 陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)是一種后天獲得性造血干細(xì)胞PIGA基因缺陷導(dǎo)致糖化磷脂酰肌醇(GPI)合成障礙而引起GPI錨蛋白缺失的慢性溶血性疾患，臨床主要表現(xiàn)為補(bǔ)體介導(dǎo)血管內(nèi)溶血、全血細(xì)胞減少、靜脈血栓形成傾向三大特征。為了進(jìn)一步揭示PNH疾病本質(zhì)，探討其特異性診斷指標(biāo)和理想治療靶點(diǎn)，我們利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)PNH患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)CD34及外周血粒、紅細(xì)胞CD59 的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。 1 資料與方法 1.1 研究對(duì)象 PNH患者20例均系2007年1月2008年12月我院血液內(nèi)科門(mén)診及住院患者;其中男11例，女9例;年齡2367歲，中位年齡41歲;

10、按血紅蛋白尿發(fā)作分為頻發(fā)組8例、偶發(fā)組7例、不發(fā)組5例;按骨髓增生程度分為增生減低組6例、增生活躍組9例、增生明顯活躍組5例;所有病例均符合文獻(xiàn)診斷標(biāo)準(zhǔn)1。骨髓正常對(duì)照組8例系胸外科非血液疾患行手術(shù)切除肋骨者;外周血正常對(duì)照組10例系健康體檢者。 1.2 實(shí)驗(yàn)方法 1.2.1 主要試劑與設(shè)備：貝克曼庫(kù)爾特流式細(xì)胞儀FC500、IgG單克隆抗體FITC、CD34單克隆抗體FITC、Optilys溶血素為美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司產(chǎn)品，CD59單克隆抗體PE、IgG單克隆抗體PE、紅細(xì)胞裂解液FACS為BD公司產(chǎn)品。 1.2.2 標(biāo)本采集及處理：常規(guī)穿刺抽取髓液2 ml于EDTA抗凝管中混勻，采用淋巴細(xì)

11、胞分離液分離BMMNC，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107/ml備用;采集晨起空腹靜脈血2 ml，EDTA抗凝。 1.2.3 BMMNC表面CD34表達(dá)：PBS洗滌BMMNC 1次，細(xì)胞沉淀加溶血?jiǎng)┘巴改└?00 l并輕輕混勻，室溫避光作用10 min，PBS洗滌1次，去上清，細(xì)胞沉淀用PBS調(diào)制成細(xì)胞濃度為106/ml的單細(xì)胞懸液。分別取100 lBMMNC懸液加入兩個(gè)試管中，對(duì)照管中加20 l IgG單抗FITC，試驗(yàn)管中加20 l CD34 單抗，輕輕振蕩混勻，室溫避光放置15 min，2 h內(nèi)采用FCM分析。 1.2.4 外周血粒細(xì)胞表面CD59表達(dá)：分設(shè)實(shí)驗(yàn)管和對(duì)照管，每管加入約含1

12、06/ml個(gè)粒細(xì)胞的抗凝全血100 l。對(duì)照管加入20 l IgG單克隆抗體PE、10 l IgG單克隆抗體PC5，實(shí)驗(yàn)管加入20 l CD59單克隆抗體PE、10 l CD45單克隆抗體PC5;混勻，室溫避光孵育30 min。加入2 ml紅細(xì)胞裂解液，靜置10 min，1000 r·min-1離心10 min，PBS洗滌2次，棄上清，加入PBS1 ml懸浮細(xì)胞，30 min內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。 1.2.5 外周血紅細(xì)胞表面CD59表達(dá)：將EDTA抗凝全血采用密度梯度離心法取得紅細(xì)胞并加入PBS制成106/ml紅細(xì)胞懸液;分設(shè)實(shí)驗(yàn)管和對(duì)照管，每管加入紅細(xì)胞懸液100 l。對(duì)照管加入20 l

13、IgG單克隆抗體PE，實(shí)驗(yàn)管加入20 l CD59單克隆抗體PE;混勻，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌2次，棄上清，加入PBS 1 ml懸浮細(xì)胞，30 min內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，采用方差分析和多組間兩兩比較q檢驗(yàn)。 2 結(jié)果 2.1 PNH各組、正常對(duì)照組BMMNC中CD34+細(xì)胞比率，見(jiàn)表1。表1 PNH患者和正常人BMMNC中CD34+細(xì)胞比率組別 經(jīng)方差分析，PNH各組BMMNC中CD34+細(xì)胞比率與正常對(duì)照組相比顯著降低(P均<0.01);其中增生減低組CD34+細(xì)胞比率顯著低于增生

14、活躍、增生明顯活躍組(P均<0.05)，而后兩組之間比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。 2.2 PNH各組、正常對(duì)照組外周血粒、紅細(xì)胞CD59表達(dá)率見(jiàn)表2。表2 PNH患者和正常人外周血粒、紅細(xì)胞CD59表達(dá)率組別 10例正常人外周血粒細(xì)胞和紅細(xì)胞CD59表達(dá)陽(yáng)性率均>95%，其中粒細(xì)胞CD59表達(dá)穩(wěn)定性較好，紅細(xì)胞CD59表達(dá)個(gè)體差異稍大。經(jīng)方差分析，PNH患者粒、紅細(xì)胞CD59表達(dá)陽(yáng)性率(均<90%)與正常對(duì)照組相比顯著減低(P均<0.001)。將PNH患者按病情分為不發(fā)組、偶發(fā)組、頻發(fā)組，粒細(xì)胞CD59在不發(fā)、偶發(fā)、頻

15、發(fā)組中表達(dá)陽(yáng)性率逐漸降低，三組之間兩兩比較差異均有顯著性(P均<0.05);紅細(xì)胞CD59在不發(fā)、偶發(fā)、頻發(fā)組中表達(dá)陽(yáng)性率雖依次有所降低，但三組之間兩兩比較差異無(wú)顯著性(P均>0.05)。 3 討論 目前研究2認(rèn)為，PNH系由于起源于造血干細(xì)胞水平的X染色體PIGA基因突變(Xp22.1)導(dǎo)致GPI合成障礙而引起血細(xì)胞表面GPI錨蛋白缺失的獲得性溶血性疾患;其亦屬于造血干細(xì)胞疾患范疇，但一顯著特征是體內(nèi)正常造血克隆與異常PNH克隆同時(shí)并存。PNH造血干細(xì)胞生物學(xué)特性與常人有何不同、異?？寺『我蚤L(zhǎng)期生存并逐漸擴(kuò)增、如何準(zhǔn)確檢測(cè)異?？寺〔⒃缙谠\斷PNH一直是臨床關(guān)注與研

16、究的熱點(diǎn)。 造血干細(xì)胞(HSC)的免疫表型特征為CD34+、Ckit+、CD38-、HLADR-、Lin-、CD45RA-、CD7-，其中最重要的是CD34分子。CD34分子是一種分子量為1.15×105的I型跨膜蛋白分子，其并非造血干細(xì)胞所特有，可從干細(xì)胞開(kāi)始連續(xù)表達(dá)直至造血前體細(xì)胞，但表達(dá)量隨細(xì)胞分化程度的提高而逐漸減低。近年來(lái)，隨著單抗技術(shù)的逐步推廣和FCM的廣泛應(yīng)用，直接檢測(cè)骨髓CD34+細(xì)胞已成為一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確鑒定HSC的方法并逐漸用于臨床常規(guī)檢查。 本研究表明，PNH患者CD34+細(xì)胞比率明顯低于正常對(duì)照組，且其減低程度與骨髓增生程度具相關(guān)性，骨髓增生減低的PNH患

17、者CD34+細(xì)胞比率減低尤為顯著;說(shuō)明PNH雖因干細(xì)胞PIGA基因突變導(dǎo)致異?？寺‘a(chǎn)生，但相對(duì)于正常人其CD34+造血干細(xì)胞在數(shù)量上仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，亦即提示PNH異?？寺”旧砜赡懿⒉痪邆鋬?nèi)在增殖優(yōu)勢(shì)，而是在骨髓正常造血功能衰竭的基礎(chǔ)上才取得相對(duì)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)而得以維持與擴(kuò)增。肖娟等3亦發(fā)現(xiàn)PNH患者骨髓CD34+造血干/祖細(xì)胞比正常人少，而且其中CD59細(xì)胞明顯多于CD59+細(xì)胞，提示PNH患者正常造血干/祖細(xì)胞數(shù)量減少、異常造血干/祖細(xì)胞在數(shù)量上占有相對(duì)優(yōu)勢(shì);Keller等4則通過(guò)PIGA基因突變的小鼠模型研究證實(shí)，單獨(dú)PIGA基因突變并非PNH克隆獲得增殖優(yōu)勢(shì)而導(dǎo)致PNH發(fā)病的唯一原因。目前趨向認(rèn)同

18、，PNH的出現(xiàn)是機(jī)體在骨髓衰竭背景下發(fā)生基因突變，導(dǎo)致血細(xì)胞表面GPI錨蛋白缺失，從而使缺陷細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)T細(xì)胞的殺傷而得以生存下來(lái)并進(jìn)一步擴(kuò)增，即機(jī)體以溶血為代價(jià)而避免了更為嚴(yán)重的骨髓衰竭5;此為PNH發(fā)病的雙重打擊學(xué)說(shuō)，亦從側(cè)面闡釋了為何PNH與骨髓造血衰竭性疾患再生障礙性貧血(AA)關(guān)系密切且可相互轉(zhuǎn)化與共存。 PNH發(fā)病過(guò)程中GPI錨蛋白尤以補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD55(衰變加速因子，DAF)和CD59(反應(yīng)性溶血膜抑制物，MRIL)最為重要;前者可加速補(bǔ)體C3轉(zhuǎn)化酶的衰變從而抑制補(bǔ)體的激活，后者則可通過(guò)與補(bǔ)體C9結(jié)合而抑制膜攻擊復(fù)合物的形成;因CD55、CD59存在于所有血細(xì)胞表面且與補(bǔ)體

19、溶血關(guān)系密切，故而將兩者缺失作為PNH克隆的標(biāo)記2。近年來(lái)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和單克隆抗體技術(shù)直接檢測(cè)血細(xì)胞表面GPI錨蛋白CD55、CD59的缺失已成為臨床診斷PNH的新型方法，當(dāng)CD55-或CD59-細(xì)胞占3%5%時(shí)即可檢出，此與傳統(tǒng)的酸化血清溶血試驗(yàn)(Ham試驗(yàn))相比敏感性更高、特異性更強(qiáng);其中CD59的檢測(cè)尤為可靠6。 本組研究發(fā)現(xiàn)，10例正常人外周血粒、紅細(xì)胞CD59表達(dá)陽(yáng)性率均>95%，其中尤以粒細(xì)胞CD59表達(dá)穩(wěn)定性為好。20例PNH患者粒、紅細(xì)胞CD59表達(dá)陽(yáng)性率與正常對(duì)照相比均顯著降低;其中粒細(xì)胞CD59在不發(fā)、偶發(fā)、頻發(fā)組中表達(dá)漸次減低，三組之間比較差異有顯著性;

20、紅細(xì)胞CD59表達(dá)則三組之間無(wú)顯著差異;提示外周血粒、紅細(xì)胞CD59缺失對(duì)PNH診斷具較高特異性及敏感性，其中粒細(xì)胞CD59缺失程度對(duì)判斷病情嚴(yán)重與否具參考價(jià)值。此與黎緯明等7報(bào)道基本一致。研究表明8，在PNH克隆發(fā)展過(guò)程中，首先累及的是粒細(xì)胞，其數(shù)量受輸血、溶血因素影響較小且CD59粒細(xì)胞多可被最早檢出且百分率最高，因而粒細(xì)胞CD59檢測(cè)對(duì)PNH早期診斷具重要價(jià)值。盡管如此，臨床實(shí)際工作中仍有不少PNH病例單用流式細(xì)胞儀CD59檢測(cè)不易確診。Brodsky等9發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的毒素aerolysin可通過(guò)與GPI蛋白連接在細(xì)胞膜上形成通道而導(dǎo)致正常細(xì)胞溶破，PNH細(xì)胞則由于缺乏GP

21、I蛋白使其具抵抗毒素作用而最終保持細(xì)胞完好;將在此基礎(chǔ)上加以技術(shù)改進(jìn)制成的Alexa488標(biāo)記前aerolysin變異體(Flaer)聯(lián)合CD59來(lái)檢測(cè)PNH克隆，可大大提高診斷的敏感性與特異性，在日后臨床應(yīng)用上具廣闊前景。 【參考文獻(xiàn)】 1 張之南，沈悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)M.第2版.北京：北京科學(xué)出版社，1998:3338. 2 Rosti V. The molecular basis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuriaJ.Haemotology，2000，85(1)：8287. 3 肖娟，武永吉，張之南，等. 陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥患者骨髓C

22、D34+CD59+細(xì)胞與CD34+CD59-細(xì)胞生物學(xué)性能的研究J.中華血液學(xué)雜志，2003，24(4)：169173. 4 Keller P，Payne JL，Tremml G，et al.FESCre targets phosphatidylinositol glycan class A (PIGA) inactivation to hematopoietic stem cells in the bone marrowJ.J Exp Med，2001,194(5)：581589. 5 Karadimitris A, Manavalan JS, Thaler HT,et al.Abnormal T