PCNA和MMP9在宮頸癌組織中的表達(dá)與意義

1、PCNA和MMP9在宮頸癌組織中的表達(dá)與意義 作者：孫紅，王浩，秦天潔，阮之平，馬瑾璐 【關(guān)鍵詞】 宮頸腫瘤;增殖細(xì)胞核抗原；明膠酶B；免疫組織化學(xué)Expressions and significance of PCNA and MMP9 in cervix cancer tissue【Abstract】 AIM: To investigate the expressions of PCNA and MMP9 in cervix cancer tissue and their significance. METHODS: The immunohistochemical SP staining

2、method was used to evaluate the PCNA and MMP9 expressions in 46 cases of cervix cancer tissues and 10 cases of normal cervix tissues. RESULTS: The expression of PCNA in cervix cancer tissues was much higher than that in normal cervix tissues (P=0.000)；The positive rate of MMP9 protein 82.61% in 46 c

3、ases of cervix cancer was significantly higher than that in 10 cases of normal cervix (30%, P<0.05). There was a positive correlation between PCNA and MMP9 expressions (rs=0.433, P=0.003). The expressions of PCNA and MMP9 were correlated with the clinical stage (P<0.05), but not with a

4、ge, pathological stage or growth pattern (P>0.05). CONCLUSION: The overexpression of MMP9 has a close relationship with the cell proliferation index in cervix cancer, suggesting that MMP9 may play an important role in the development of cervix cancer. 【Keywords】 cervix neoplasms; proliferatin

5、g cell nuclear antigen (PCNA); gelatinase B; immunohistochemistry【摘要】 目的： 探討PCNA，MMP9在宮頸癌組織中的表達(dá)及臨床意義. 方法： 用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)46例宮頸癌及10例正常宮頸中PCNA和MMP9的表達(dá)，分析不同組織中PCNA和MMP9表達(dá)的差異及兩者的相關(guān)性. 結(jié)果： 宮頸癌組織PCNA的表達(dá)明顯高于正常宮頸組織(P=0.000)；38例宮頸癌的MMP9陽(yáng)性表達(dá)（82.61%）明顯高于10例正常宮頸組織的表達(dá)(30%， P0.05)；PCNA的表達(dá)與MMP9的表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.433, P=0.00

6、3），且PCNA和MMP9均與臨床分期有關(guān)（P0.05），而與年齡、病例分級(jí)及生長(zhǎng)方式無(wú)關(guān)（P0.05）. 結(jié)論： MMP9在宮頸癌組織中表達(dá)異常增高，與細(xì)胞增殖關(guān)系密切，提示其對(duì)宮頸癌的發(fā)展起重要作用.【關(guān)鍵詞】 宮頸腫瘤;增殖細(xì)胞核抗原；明膠酶B；免疫組織化學(xué)0引言宮頸癌是最常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)腫瘤，其局部侵襲力強(qiáng)，易直接蔓延和經(jīng)過(guò)淋巴道轉(zhuǎn)移. 從原位癌增殖到侵襲轉(zhuǎn)移癌的演進(jìn)過(guò)程,一方面依賴于腫瘤細(xì)胞本身的惡性潛能，另一方面是其實(shí)質(zhì)與間質(zhì)之間相互作用的結(jié)果. 增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）是DNA聚合酶的輔助因子，能反映細(xì)胞

7、增殖活性 . 基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases9, MMP9)屬于基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）家族成員，能降解, ,型膠原及纖維粘連蛋白等基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)成分，從而促進(jìn)惡性腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及間質(zhì)血管新生；而間質(zhì)血管新生則為腫瘤組織提供營(yíng)養(yǎng)并排出其廢物，使腫瘤得以持續(xù)迅速生長(zhǎng)和發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移 . 為進(jìn)一步探討宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)理，我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)不同宮頸組織中MMP9和PCNA基因的表達(dá)，并討論其臨床意義.1對(duì)象和方法1.1對(duì)象200501/200602收治經(jīng)病理確診的活檢標(biāo)本，年齡2770（

8、平均48.6）歲. 46例宮頸癌浸潤(rùn)癌按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO， 1995）修訂的宮頸癌臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，期28例，(60.9%)，期18例(39.1%). 按WHO病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)：G16例(13.0%)；G228例(60.9%)；G312例(26.1%). 高、中、低分化相當(dāng)于病理分級(jí)13級(jí). 常規(guī)40 g/L甲醛固定、石蠟包埋，切片厚45 m. 以10例正常宮頸組織作對(duì)照.1.2方法鼠抗人MMP9抗體、小鼠抗大鼠PCNA抗體及通用型SP 9000試劑盒，山羊血清，生物素標(biāo)記的二抗，抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素抗生素，二氨基聯(lián)苯胺顯色液購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品. 一抗稀釋度均為13

9、0. MMP9和PCNA的免疫組織化學(xué)染色法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，采用鏈霉素抗生物素蛋白過(guò)氧化酶免疫染色（SP）法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，切片常規(guī)脫蠟水化后，于檸檬酸緩沖液中煮沸10 min，保溫10 min作抗原修復(fù)；PBS沖洗后山羊血清工作液孵育，滴加一抗37孵育2 h, PBS沖洗3次. 滴加二抗，PBS沖洗3次. 滴加三抗，孵育，PBS沖洗3次，DAB顯色，復(fù)染、脫水、透明、封片后鏡下觀察. 一抗以PBS為陰性對(duì)照. PCNA以胞核出現(xiàn)棕黃色顆?；蜃睾稚w粒為陽(yáng)性細(xì)胞，對(duì)每例切片進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),隨機(jī)取10個(gè)視野，記陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)，用標(biāo)記指數(shù)LI表示，即LI(%)（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞）100，取

10、平均值定義為腫瘤的PCNA的LI3. MMP9蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性結(jié)果以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色為準(zhǔn). 結(jié)果判定采用半定量積分法4，并根據(jù)每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞比例及著色深淺計(jì)分，著色細(xì)胞比例1p3以下為1分；1p3 2p3為2分 ；2p3以上為3分. 著色深度：無(wú)著色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分. 根據(jù)兩者的乘積判斷陽(yáng)性等級(jí)：0分為（-）；12分為（+）;34分為（） ；>4分為（）.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各指標(biāo)間的相關(guān)采用Spearman相關(guān)分析法，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn), 兩組間表達(dá)率比較采用2檢驗(yàn)，P<

11、0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1PCNA蛋白表達(dá)PCNA免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞為胞核著色，46例宮頸組織中均有不同程度PCNA的陽(yáng)性表達(dá)，PCNA標(biāo)記指數(shù)為4.00%71.06%，在中、晚期惡性腫瘤組織中PCNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,分化程度越差，PCNA表達(dá)越高，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異. 而PCNA的表達(dá)與年齡、生長(zhǎng)方式無(wú)明顯相關(guān)性. 正常宮頸組織見(jiàn)PCNA極微弱陽(yáng)性染色,10例正常組織PCNA標(biāo)記指數(shù)不足5%（表1）.2.2MMP9蛋白表達(dá)MMP9免疫組化陽(yáng)性的表達(dá)主要位于細(xì)胞的胞質(zhì)和細(xì)胞膜，腫瘤細(xì)胞間質(zhì)均呈均質(zhì)性的弱陽(yáng)性反應(yīng). MMP9陽(yáng)性的癌細(xì)胞均呈灶狀或

12、片狀分布，且多位于癌邊緣. 宮頸癌組織多呈陽(yáng)性、中度陽(yáng)性表達(dá). 正常宮頸組織MMP9表達(dá)多為陰性或弱陽(yáng)性. MMP9在宮頸癌的表達(dá)率為82.61%，不同年齡組中的表達(dá)分別為87.50%（<49歲），72.72%（49歲）；在中、晚期患者中的表達(dá)分別為71.42%和100.00%；在低分化及中高分化的表達(dá)分別為83.33%，82.35%；在菜花型和結(jié)節(jié)型生長(zhǎng)方式中的表達(dá)分別為93.75%，57.14%，其中在中、晚期患者中的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與其余各項(xiàng)臨床病理參數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 46例宮頸癌組織中兩者表達(dá)陽(yáng)性者38例（82.61%），呈正相關(guān)（rs

13、=0.433, P=0.003）. 表146例患者PCNA和MMMP9的表達(dá)（略）aP<0.05 vs 期.3討論宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展是多基因、多因素及分子水平多階段的過(guò)程. 目前宮頸癌的發(fā)病率有上升趨勢(shì)，尤其年輕宮頸癌發(fā)生率上升趨勢(shì)更加明顯5. 增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤主要的生物學(xué)特征，也是影響治療效果和預(yù)后的主要因素.PCNA是DNA聚合酶的輔助因子，屬于一種酸性核蛋白，參與DNA的合成并在細(xì)胞周期中起重要的調(diào)控作用. PCNA在DNA的合成的G1期開(kāi)始增加，至S期達(dá)到高峰，G2/M期迅速降低. 這種變化恰好與細(xì)胞增殖周期過(guò)程相關(guān). 由于PCNA的合成與表達(dá)和細(xì)胞增殖活性密切

14、相關(guān)，因此檢測(cè)PCNA可以反映癌細(xì)胞DNA的合成情況，為癌細(xì)胞增殖活性提供客觀指標(biāo). PCNA不僅在DNA復(fù)制中起關(guān)鍵作用，而且許多細(xì)胞內(nèi)外增殖信號(hào)都須經(jīng)過(guò)PCNA的參與，才能引發(fā)細(xì)胞DNA合成及分裂增殖6. 研究發(fā)現(xiàn)，PCNA與許多惡性腫瘤如腦星形細(xì)胞瘤、宮頸癌、肝癌、乳腺癌等地病理分級(jí)、臨床分期及淋巴結(jié)或臟器轉(zhuǎn)移有關(guān)，并可用于臨床診斷、指導(dǎo)治療以及預(yù)后評(píng)估. 本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者PCNALI與正常宮頸組相比有顯著性差異（P<0.05），說(shuō)明宮頸癌細(xì)胞有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)失控、DNA合成紊亂現(xiàn)象. 細(xì)胞的異常增殖對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起了重要作用，而與增殖相關(guān)基因的異常表達(dá)恰恰解釋了細(xì)胞的異常

15、增殖. 本研究中PCNA的陽(yáng)性表達(dá)與宮頸癌的浸潤(rùn)深度有關(guān)，分期越晚PCNA的表達(dá)越高. 這提示宮頸癌一旦浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移后，癌細(xì)胞增殖活性大大增加，惡性程度明顯增高. 本研究發(fā)現(xiàn)分化程度越低，PCNA的表達(dá)越高，這與文獻(xiàn)報(bào)道腫瘤細(xì)胞的分化程度越低，增殖指數(shù)增高，惡性越高相一致，但本研究未發(fā)現(xiàn)具有顯著性差異，可能與病例數(shù)較少有關(guān).基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力之間有著密切的關(guān)系. 腫瘤新生血管的形成過(guò)程中包括毛細(xì)血管內(nèi)皮下層基底膜降解，內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖、新生血管形成和新的基底膜形成等一系列過(guò)程7. MMP9是MMPs中分子量最大的酶，是一類(lèi)分解細(xì)胞外基質(zhì)組分的鋅蛋白酶,它以酶原的形式

16、分泌，被激活后形成型膠原酶. 一方面降解、破壞靠近腫瘤表面的細(xì)胞外基質(zhì)和血管壁的基底膜，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，另一方面則通過(guò)毛細(xì)血管內(nèi)生、新生血管生成促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移. 基質(zhì)蛋白酶是高度保守的一類(lèi)酶，可以特異降解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)中的一種或幾種蛋白質(zhì)，故可以降解所有的細(xì)胞外基質(zhì)，由此MMPS降解細(xì)胞外基質(zhì)是腫瘤細(xì)胞向瘤灶周?chē)忠u性生長(zhǎng)的關(guān)鍵事件8. 本研究發(fā)現(xiàn)在增長(zhǎng)正常組織中MMP9呈低水平表達(dá)或陰性表達(dá)，而在腫瘤組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，且MMP9的表達(dá)量在兩者中有顯著差異（P<0.05）. 本研究發(fā)現(xiàn)PCNA, MMP9在宮頸癌組織中的表達(dá)中隨著病理分期越高表達(dá)指數(shù)明顯增高. 有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)

17、道癌細(xì)胞MMP9表達(dá)增強(qiáng)與其增殖指數(shù)的增加有關(guān)，MMP9表達(dá)細(xì)胞增殖指數(shù)明顯高于陰性對(duì)照組，提示MMP9具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能. PCNA蛋白檢測(cè)可直接反映細(xì)胞合成代謝及增殖狀態(tài) . 而MMP9基因調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平，多種MMP基因的增強(qiáng)子區(qū)域有高度的調(diào)控元件的保守性，由生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和環(huán)境因素誘導(dǎo)表達(dá). 宮頸癌組織中MMP9表達(dá)與正常組織相比明顯增高，與細(xì)胞增殖關(guān)系密切，提示MMP9基因的激活可能通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，以及降解細(xì)胞外基質(zhì)和血管壁的基底膜促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展. 可以推測(cè)，兩者表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞中，PCNA促進(jìn)細(xì)胞的大量增殖，而MMP9能夠破壞細(xì)胞外基質(zhì)，提供癌細(xì)胞的發(fā)展空間和轉(zhuǎn)移

18、通道，兩者相互協(xié)同，可能造成了宮頸癌易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的特征. 針對(duì)二者的靶向治療，則有可能阻斷宮頸癌的進(jìn)程. 有關(guān)MMP9與PCNA對(duì)宮頸癌預(yù)后的關(guān)系需做進(jìn)一步隨訪研究.【參考文獻(xiàn)】1 FernandezSanchez M, GamboaDominguez A, Uribe N, et al. Clinical and pathological predictors of the response to neoadjuvant anthracycline chemotherapy in locally advanced breast cancer J. Med Oncol, 2006,23(2):1

19、71-183.2 Rytkonen AK, Vaara M, Nethanel T, et al. Distinctive activities of DNA polymerases during human DNA replication J. FEBS J,2006,273(13):2984-3001.3 Nair A, Venkatraman M, Maliekal TT, et al. NFk is constitutively activated in high grade squamous in traeoithelial lesions and squamous cell carcinomas of the huaman uterine cervix J. Oncogen