原代細(xì)胞培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的方法及其

1、初代培養(yǎng)原理     將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。     儀器、材料及試劑     儀器：培養(yǎng)箱（調(diào)整至37），培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術(shù)器械、血球計數(shù)板、離心機、水浴箱（37）     材料：動物組織塊     試劑：1640培養(yǎng)基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hanks液，碘酒

2、初代消化培養(yǎng)法1. 準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒20分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2. 布局：點燃酒精燈，安裝吸管帽。3. 處理組織：把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗23次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中3060分鐘。4. 剪切：用眼科剪把組織切成23毫米大小的塊，以便于消化。加入比組織塊總量多3050倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結(jié)扎瓶口或塞以膠塞。5. 消化：或用恒溫水浴，或置于37溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應(yīng)搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。6. 分離

3、：在消化過程中見消化液發(fā)混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細(xì)胞團或單個細(xì)胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速（5001000轉(zhuǎn)/分）離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。7. 計數(shù)：用計數(shù)板計數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過大，再補加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中。對大多數(shù)細(xì)胞來說，pH要求在7.27.4范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說明液體變酸，可用NaHCO3調(diào)整。8. 培養(yǎng)：置于36.5溫箱培養(yǎng)，如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需要換新塞。初代組織塊培養(yǎng)法1. 剪切：把組織小塊

4、置于小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸靜Hanks液，用眼科剪反復(fù)剪切1mm3塊為止。2. 擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置于培養(yǎng)瓶中，用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底部，小塊相互距離以0.5cm為宜，每一25ml培養(yǎng)瓶底可擺布2030塊。3. 輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，另瓶底向上，注意翻瓶時勿令組織小塊流動，塞好瓶塞，置36.5溫箱培養(yǎng)2小時左右（勿超過4小時），使小塊微干涸。4. 培養(yǎng)：從微箱中取出培養(yǎng)瓶，開塞，46度斜持培養(yǎng)瓶，箱瓶底腳部輕輕注入培養(yǎng)液少許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊游出數(shù)量增多

5、后。再補加培養(yǎng)液。傳代培養(yǎng)法原理     細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時也將細(xì)胞數(shù)量擴大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。 傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。材料和試劑 1. 細(xì)胞：貼壁細(xì)胞株 2. 試劑：0.25胰酶、1640培養(yǎng)基（含10小牛血清） 3. 儀器和器材：倒置顯微鏡，培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等   操作步驟1. 吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。2. 向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶和EDTA混合液少許，以能覆滿瓶底為限。3.

6、 置溫箱中25分鐘，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，立即終止消化。4. 吸除消化液，向瓶內(nèi)注入Hanks液數(shù)毫升，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，把殘余消化液沖掉。注意加Hanks液沖洗細(xì)胞時，動作要輕，以免把已松動的細(xì)胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液單獨消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液沖洗，直接加入培養(yǎng)液。5. 用吸管吸取營養(yǎng)液輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。6. 計數(shù)板計數(shù)后，把細(xì)胞懸液分成等份分裝入數(shù)個培養(yǎng)瓶中，置溫箱中培養(yǎng)。無菌操作注意事項 1. 操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。 2. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物

7、品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。 3. 操作動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。 4. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。 5. 瓶子開口后要盡量保持45斜位。 6. 吸溶液的吸管等不能混用。初代培養(yǎng)原理     將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。    &#

8、160;儀器、材料及試劑     儀器：培養(yǎng)箱（調(diào)整至37），培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術(shù)器械、血球計數(shù)板、離心機、水浴箱（37）     材料：動物組織塊     試劑：1640培養(yǎng)基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hanks液，碘酒初代消化培養(yǎng)法1. 準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒20分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2. 布局：點燃酒精燈，安裝吸管帽。3. 處理組織：把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗23次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青

9、鏈霉素的混合液中3060分鐘。4. 剪切：用眼科剪把組織切成23毫米大小的塊，以便于消化。加入比組織塊總量多3050倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結(jié)扎瓶口或塞以膠塞。5. 消化：或用恒溫水浴，或置于37溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應(yīng)搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。6. 分離：在消化過程中見消化液發(fā)混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細(xì)胞團或單個細(xì)胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速（5001000轉(zhuǎn)/分）離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。7. 計數(shù)：用計數(shù)板計

10、數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過大，再補加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中。對大多數(shù)細(xì)胞來說，pH要求在7.27.4范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說明液體變酸，可用NaHCO3調(diào)整。8. 培養(yǎng)：置于36.5溫箱培養(yǎng)，如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需要換新塞。初代組織塊培養(yǎng)法1. 剪切：把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸靜Hanks液，用眼科剪反復(fù)剪切1mm3塊為止。2. 擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置于培養(yǎng)瓶中，用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底部，小塊相互距離以0.5cm為宜，每一25ml培養(yǎng)瓶底可擺布203

11、0塊。3. 輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，另瓶底向上，注意翻瓶時勿另組織小塊流動，塞好瓶塞，置36.5溫箱培養(yǎng)2小時左右（勿超過4小時），使小塊微干涸。4. 培養(yǎng)：從微箱中取出培養(yǎng)瓶，開塞，46度斜持培養(yǎng)瓶，箱瓶底腳部輕輕注入培養(yǎng)液少許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊游出數(shù)量增多后。再補加培養(yǎng)液。傳代培養(yǎng)法原理     細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時也將細(xì)胞數(shù)量擴大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。 傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細(xì)

12、胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。材料和試劑 1. 細(xì)胞：貼壁細(xì)胞株 2. 試劑：0.25胰酶、1640培養(yǎng)基（含10小牛血清） 3. 儀器和器材：倒置顯微鏡，培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等   操作步驟1. 吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。2. 向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶和EDTA混合液少許，以能覆滿瓶底為限。3. 置溫箱中25分鐘，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，立即終止消化。4. 吸除消化液，向瓶內(nèi)注入Hanks液數(shù)毫升，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，把殘余消化液沖掉。注意加Hanks液沖洗細(xì)胞時，動作要輕，以免把已松動的細(xì)胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液單獨消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用

13、Hanks液沖洗，直接加入培養(yǎng)液。5. 用吸管吸取營養(yǎng)液輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。6. 計數(shù)板計數(shù)后，把細(xì)胞懸液分成等份分裝入數(shù)個培養(yǎng)瓶中，置溫箱中培養(yǎng)。無菌操作注意事項 1. 操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。 2. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。 3. 操作動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。 4. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。

14、5. 瓶子開口后要盡量保持45斜位。 6. 吸溶液的吸管等不能混用。初代培養(yǎng)原理     將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。     儀器、材料及試劑     儀器：培養(yǎng)箱（調(diào)整至37），培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術(shù)器械、血球計數(shù)板、離心機、水浴箱（37）     材料：動物組織塊     試劑：1

15、640培養(yǎng)基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hanks液，碘酒初代消化培養(yǎng)法1. 準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒20分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2. 布局：點燃酒精燈，安裝吸管帽。3. 處理組織：把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗23次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中3060分鐘。4. 剪切：用眼科剪把組織切成23毫米大小的塊，以便于消化。加入比組織塊總量多3050倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結(jié)扎瓶口或塞以膠塞。5. 消化：或用恒溫水浴，或置于37溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應(yīng)搖動一次，如用電磁恒

16、溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。6. 分離：在消化過程中見消化液發(fā)混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細(xì)胞團或單個細(xì)胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速（5001000轉(zhuǎn)/分）離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。7. 計數(shù)：用計數(shù)板計數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過大，再補加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中。對大多數(shù)細(xì)胞來說，pH要求在7.27.4范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說明液體變酸，可用NaHCO3調(diào)整。8. 培養(yǎng)：置于36.5溫箱培養(yǎng)，如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞，紗布塞易

17、生霉菌，每次換液時需要換新塞。初代組織塊培養(yǎng)法1. 剪切：把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸靜Hanks液，用眼科剪反復(fù)剪切1mm3塊為止。2. 擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置于培養(yǎng)瓶中，用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底部，小塊相互距離以0.5cm為宜，每一25ml培養(yǎng)瓶底可擺布2030塊。3. 輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，另瓶底向上，注意翻瓶時勿另組織小塊流動，塞好瓶塞，置36.5溫箱培養(yǎng)2小時左右（勿超過4小時），使小塊微干涸。4. 培養(yǎng)：從微箱中取出培養(yǎng)瓶，開塞，46度斜持培養(yǎng)瓶，箱瓶底腳部輕輕注入培養(yǎng)液少許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，讓培養(yǎng)液慢慢覆

18、蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊游出數(shù)量增多后。再補加培養(yǎng)液。傳代培養(yǎng)法原理     細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時也將細(xì)胞數(shù)量擴大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。 傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。材料和試劑 1. 細(xì)胞：貼壁細(xì)胞株 2. 試劑：0.25胰酶、1640培養(yǎng)基（含10小牛血清） 3. 儀器和器材：倒置顯微鏡，培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等   操作步驟1. 吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。

19、2. 向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶和EDTA混合液少許，以能覆滿瓶底為限。3. 置溫箱中25分鐘，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，立即終止消化。4. 吸除消化液，向瓶內(nèi)注入Hanks液數(shù)毫升，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，把殘余消化液沖掉。注意加Hanks液沖洗細(xì)胞時，動作要輕，以免把已松動的細(xì)胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液單獨消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液沖洗，直接加入培養(yǎng)液。5. 用吸管吸取營養(yǎng)液輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。6. 計數(shù)板計數(shù)后，把細(xì)胞懸液分成等份分裝入數(shù)個培養(yǎng)瓶中，置溫箱中培養(yǎng)。無菌操作注意事項 1. 操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試

20、。試劑等瓶口也要擦試。 2. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。 3. 操作動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。 4. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。 5. 瓶子開口后要盡量保持45斜位。 6. 吸溶液的吸管等不能混用。初代培養(yǎng)原理     將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和

21、繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。     儀器、材料及試劑     儀器：培養(yǎng)箱（調(diào)整至37），培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術(shù)器械、血球計數(shù)板、離心機、水浴箱（37）     材料：動物組織塊     試劑：1640培養(yǎng)基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hanks液，碘酒初代消化培養(yǎng)法1. 準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒20分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2. 布局：點燃酒精燈，安裝吸管帽。3. 處理組織：把組織塊置于燒杯中，用

22、Hanks液漂洗23次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中3060分鐘。4. 剪切：用眼科剪把組織切成23毫米大小的塊，以便于消化。加入比組織塊總量多3050倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結(jié)扎瓶口或塞以膠塞。5. 消化：或用恒溫水浴，或置于37溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應(yīng)搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。6. 分離：在消化過程中見消化液發(fā)混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細(xì)胞團或單個細(xì)胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速（5001000轉(zhuǎn)/分）離心消化

23、液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。7. 計數(shù)：用計數(shù)板計數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過大，再補加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中。對大多數(shù)細(xì)胞來說，pH要求在7.27.4范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說明液體變酸，可用NaHCO3調(diào)整。8. 培養(yǎng)：置于36.5溫箱培養(yǎng)，如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需要換新塞。初代組織塊培養(yǎng)法1. 剪切：把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸靜Hanks液，用眼科剪反復(fù)剪切1mm3塊為止。2. 擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置于培養(yǎng)瓶中，用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底部，小塊相互距離以0.5cm為宜，每一25ml培養(yǎng)瓶底可擺布2030塊。3. 輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，另瓶底向上，注意翻瓶時勿另組織小塊流動，塞好瓶塞，置36.5溫箱培養(yǎng)2小時左右（勿超過4小時），使小塊微干涸。4. 培養(yǎng)：從微箱中取出培養(yǎng)瓶，開塞，46度斜持培養(yǎng)瓶，箱瓶底腳部輕輕注入培養(yǎng)液少許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱