(5)高通量測(cè)序：環(huán)境微生物群落多樣性分析

1、(5)高通量測(cè)序：環(huán)境微生物群落多樣性分析 微生物群落多樣性的基本概念環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)及多樣性和微生物的功能及代謝機(jī)理是微生物生態(tài)學(xué)的研究熱點(diǎn)。長(zhǎng)期以來，由于受到技術(shù)限制，對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的認(rèn)識(shí)還不全面，對(duì)微生物功能及代謝機(jī)理方面了解的也很少。但隨著高通量測(cè)序、基因芯片等新技術(shù)的不斷更新，微生物分子生態(tài)學(xué)的研究方法和研究途徑也在不斷變化。第二代高通量測(cè)序技術(shù)（尤其是Roche454高通量測(cè)序技術(shù)）的成熟和普及，使我們能夠?qū)Νh(huán)境微生物進(jìn)行深度測(cè)序，靈敏地探測(cè)出環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)隨外界環(huán)境的改變而發(fā)生的極其微弱的變化，對(duì)于我們研究微生物與環(huán)境的關(guān)系、環(huán)境治理和微生物資源的利用以及人類

2、醫(yī)療健康有著重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。在國(guó)內(nèi)，微生物多樣性的研究涉及農(nóng)業(yè)、土壤、林業(yè)、海洋、礦井、人體醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域。以在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用為例，通過比較正常和疾病狀態(tài)下或疾病不同進(jìn)程中人體微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能變化，可以對(duì)正常人群與某些疾病患者體內(nèi)的微生物群體多樣性進(jìn)行比較分析，研究獲得人體微生物群落變化同疾病之間的關(guān)系；通過深度測(cè)序還可以快速地發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)常見病原及新發(fā)傳染病病原微生物。研究方法進(jìn)展環(huán)境微生物多樣性的研究方法很多，從國(guó)內(nèi)外目前采用的方法來看大致上包括以下四類：傳統(tǒng)的微生物平板純培養(yǎng)方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物學(xué)方法等等。近幾年，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，尤其是高通量測(cè)序

3、技術(shù)的研發(fā)及應(yīng)用，為微生物分子生態(tài)學(xué)的研究策略注入了新的力量。目前用于研究微生物多樣性的分子生物學(xué)技術(shù)主要包括:DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印記雜交、定量PCR、基因芯片等。DGGE等分子指紋圖譜技術(shù)，在其實(shí)驗(yàn)結(jié)果中往往只含有數(shù)十條條帶，只能反映出樣品中少數(shù)優(yōu)勢(shì)菌的信息；另一方面，由于分辨率的誤差，部分電泳條帶中可能包含不只一種16SrDNA序列，因此要獲悉電泳圖譜中具體的菌種信息，還需對(duì)每一條帶構(gòu)建克隆文庫(kù)，并篩選克隆進(jìn)行測(cè)序，此實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)繁瑣；此外，采用這種方法無法對(duì)樣品中的微生物做到絕對(duì)定量。生物芯片是通過固定在芯片上的探針來獲得微生物多樣性的信息，

4、“只能驗(yàn)證已知，卻無法探索未知”，此方法通過信號(hào)強(qiáng)弱判斷微生物的豐度也不是非常的準(zhǔn)確。而近年來以454焦磷酸測(cè)序?yàn)榇淼母咄繙y(cè)序技術(shù)憑借低成本、高通量、流程自動(dòng)化的優(yōu)勢(shì)為研究微生物群落結(jié)構(gòu)提供了新的技術(shù)平臺(tái)。Roche454高通量測(cè)序技術(shù)能同時(shí)對(duì)樣品中的優(yōu)勢(shì)物種、稀有物種及一些未知的物種進(jìn)行檢測(cè)，獲得樣品中的微生物群落組成，并將其含量進(jìn)行數(shù)字化。最近，美吉生物推出了新的測(cè)序平臺(tái)MiSeq。MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)集中了Roche454和Illumina HiSeq2500的優(yōu)點(diǎn)，不僅可實(shí)現(xiàn)對(duì)多樣品的多個(gè)可變區(qū)同時(shí)測(cè)序，而且在測(cè)序速度和測(cè)序通量上都有進(jìn)一步提升，目前此平臺(tái)已在微生物多樣性群落結(jié)

5、構(gòu)研究方面受到了廣大學(xué)者的認(rèn)可。第二代高通量測(cè)序技術(shù)產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)無需培養(yǎng)分離菌群：直接從環(huán)境樣本中擴(kuò)增核糖體RNA高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序，解決了大部分菌株不可培養(yǎng)的難題?？陀^還原菌群結(jié)構(gòu)：專業(yè)、成熟、穩(wěn)定的樣本制備流程，嚴(yán)格控制PCR循環(huán)數(shù)，客觀還原樣品本身的菌群結(jié)構(gòu)及豐度比例。痕量菌檢測(cè)：充分發(fā)揮高通量測(cè)序的大數(shù)據(jù)量?jī)?yōu)勢(shì)，能檢測(cè)出豐度低至萬分之一的痕量菌。生信分析1. 稀釋性曲線（Rarefaction Curve）采用對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建曲線，即稀釋性曲線。當(dāng)曲線趨于平坦時(shí)，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量對(duì)發(fā)現(xiàn)新OTU的邊際貢獻(xiàn)很?。环粗畡t表明繼

6、續(xù)測(cè)序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。橫軸：從某個(gè)樣品中隨機(jī)抽取的測(cè)序條數(shù)；"Label 0.03"表示該分析是基于OTU 序列差異水平在0.03，即相似度為97% 的水平上進(jìn)行運(yùn)算的，客戶可以選取其他不同的相似度水平?？v軸：基于該測(cè)序條數(shù)能構(gòu)建的OTU數(shù)量。曲線解讀：? 圖1中每條曲線代表一個(gè)樣品，用不同顏色標(biāo)記；? 隨測(cè)序深度增加，被發(fā)現(xiàn)OTU 的數(shù)量增加。當(dāng)曲線趨于平緩時(shí)表示此時(shí)的測(cè)序數(shù)據(jù)量較為合理。2. Shannon-Wiener曲線反映樣品中微生物多樣性的指數(shù)，利用各樣品的測(cè)序量在不同測(cè)序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各樣本在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。

7、當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物物種信息。 橫軸：從某個(gè)樣品中隨機(jī)抽取的測(cè)序條數(shù)?？v軸：Shannon-Wiener 指數(shù)，用來估算群落多樣性的高低。Shannon 指數(shù)計(jì)算公式：其中，Sobs= 實(shí)際測(cè)量出的OTU數(shù)目；ni= 含有i 條序列的OTU數(shù)目；N = 所有的序列數(shù)。曲線解讀：? 圖2每條曲線代表一個(gè)樣品，用不同顏色標(biāo)記，末端數(shù)字為實(shí)際測(cè)序條數(shù)；? 起初曲線直線上升，是由于測(cè)序條數(shù)遠(yuǎn)不足覆蓋樣品導(dǎo)致；? 數(shù)值升高直至平滑說明測(cè)序條數(shù)足以覆蓋樣品中的大部分微生物。3.Rank-Abundance曲線用于同時(shí)解釋樣品多樣性的兩個(gè)方面，即樣品所含物種

8、的豐富程度和均勻程度。物種的豐富程度由曲線在橫軸上的長(zhǎng)度來反映，曲線越寬，表示物種的組成越豐富；物種組成的均勻程度由曲線的形狀來反映，曲線越平坦，表示物種組成的均勻程度越高。橫軸：OTU 相對(duì)豐度含量等級(jí)降序排列。縱軸：相對(duì)豐度比例。曲線解讀：? 圖3與圖4中每條曲線對(duì)應(yīng)一個(gè)樣本（參考右上角圖標(biāo)）；? 圖3與圖4中橫坐標(biāo)表示的是OTU（物種）豐度排列順序，縱坐標(biāo)對(duì)應(yīng)的是OTU（物種）所占相對(duì)豐度比例（圖3為相對(duì)百分比例，圖4為換算后Log值），曲線趨于水平則表示樣品中各物種所占比例相似；曲線整體斜率越大則表示樣品中各物種所占比例差異較大。4. 樣本群落組成分析：多樣本柱狀圖/單樣本餅狀圖 根據(jù)

9、分類學(xué)分析結(jié)果，可以得知一個(gè)或多個(gè)樣品在各分類水平上的物種組成比例情況，反映樣品在不同分類學(xué)水平上的群落結(jié)構(gòu)。柱狀圖（圖5）橫軸：各樣品的編號(hào)。縱軸：相對(duì)豐度比例。圖標(biāo)解讀：? 顏色對(duì)應(yīng)此分類學(xué)水平下各物種名稱，不同色塊寬度表示不同物種相對(duì)豐度比例；? 可以在不同分類學(xué)水平下作圖分析。餅狀圖（圖6）在某一分類學(xué)水平上，不同菌群所占的相對(duì)豐度比例。不同顏色代表不同的物種。5. 樣品OTU 分布Venn 圖用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣品中共有或獨(dú)有的OTU數(shù)目，可以比較直觀地表現(xiàn)各環(huán)境樣品之間的OTU 組成相似程度。不同樣品用不同顏色標(biāo)記，各個(gè)數(shù)字代表了某個(gè)樣品獨(dú)有或幾種樣品共有的OTU 數(shù)量，對(duì)應(yīng)的OTU編號(hào)

10、會(huì)以EXCEL 表的形式在結(jié)題報(bào)告中呈現(xiàn)。 分析要求單張分析圖，樣本分組至少兩個(gè)，最多5 個(gè)。? 默認(rèn)設(shè)置為97% 相似度水平下以O(shè)TU 為單位進(jìn)行分析作圖。6. Heatmap 圖用顏色變化來反映二維矩陣或表格中的數(shù)據(jù)信息，它可以直觀地將數(shù)據(jù)值的大小以定義的顏色深淺表示出來。將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色梯度及相似程度來反映多個(gè)樣品在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。 相對(duì)豐度比例：熱圖（圖8）中每小格代表其所在樣品中某個(gè)OTU 的相對(duì)豐度。以圖8為例，紅框高亮的小格所對(duì)應(yīng)的信息為：樣本（R11-1Z）中OTU（OTU128）的相對(duì)豐度比例大概為0.2%。豐度比例計(jì)算公式（Br

11、ay Curtis 算法）：其中，SA,i = 表示A樣品中第i個(gè)OTU所含的序列數(shù)SB,i = 表示B樣品中第i個(gè)OTU所含的序列數(shù)樣品間聚類關(guān)系樹：進(jìn)化樹表示在選用成圖數(shù)據(jù)中，樣本與樣本間序列的進(jìn)化關(guān)系（差異關(guān)系）。處于同一分支內(nèi)的樣品序列進(jìn)化關(guān)系相近。物種/OTU 豐度相似性樹：豐度相似性樹表示選用成圖的數(shù)據(jù)中樣品與樣品中的OTU 或序列在豐度上的相似程度。豐度最相近的會(huì)分配到同一分支上?？蛻糇远x分組：根據(jù)研究需求對(duì)菌群物種/OTU 研究樣本進(jìn)行二級(jí)分組? 二級(jí)物種/OTU 分組：將下級(jí)分類學(xué)水平物種或OTU 分配到對(duì)應(yīng)的上級(jí)分類學(xué)水平，以不同顏色區(qū)分；? 二級(jí)樣品分組：根據(jù)研究需要，

12、對(duì)樣品進(jìn)行人為的分組，以不同顏色區(qū)分。7. 主成分分析PCA (Principal Component Analysis)在多元統(tǒng)計(jì)分析中，主成分分析是一種簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)集的技術(shù)。主成分分析經(jīng)常用于減少數(shù)據(jù)集的維數(shù)，同時(shí)保持?jǐn)?shù)據(jù)集中對(duì)方差貢獻(xiàn)最大的特征，從而有效地找出數(shù)據(jù)中最“主要”的元素和結(jié)構(gòu)，去除噪音和冗余，將原有的復(fù)雜數(shù)據(jù)降維，揭示隱藏在復(fù)雜數(shù)據(jù)背后的簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)。通過分析不同樣品的OTU 組成可以反映樣品間的差異和距離，PCA 運(yùn)用方差分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，坐標(biāo)軸為能夠最大程度反映方差的兩個(gè)特征值。如樣品組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近。 橫軸和縱軸：以百分?jǐn)?shù)的形式體現(xiàn)

13、主成分主要影響程度。以圖9為例，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）是造成四組樣品（紅色，藍(lán)色，黃色和綠色）的兩個(gè)最大差異特征，貢獻(xiàn)率分別為41.1% 和27.1%。十字交叉線：在圖9中作為0 點(diǎn)基線存在，起到輔助分析的作用，本身沒有意義。圖例解讀：? PCA 分析圖是基于每個(gè)樣品中所含有的全部OTU 完成的；? 圖9中每個(gè)點(diǎn)代表了一個(gè)樣本；顏色則代表不同的樣品分組；? 兩點(diǎn)之間在橫、縱坐標(biāo)上的距離，代表了樣品受主成分（PC1 或 PC2）影響下的相似性距離；? 樣本數(shù)量越多，該分析意義越大；反之樣本數(shù)量過少，會(huì)產(chǎn)生個(gè)體差異，導(dǎo)致PCA分析成圖后形成較大距離的分開，建議多組樣品時(shí)，每組不少于

14、5個(gè)，不分組時(shí)樣品不少于10個(gè)；? 圖10中的圓圈為聚類分析結(jié)果，圓圈內(nèi)的樣品，其相似距離比較接近。8. RDA/ CCA分析圖基于對(duì)應(yīng)分析發(fā)展的一種排序方法，將對(duì)應(yīng)分析與多元回歸分析相結(jié)合，每一步計(jì)算均與環(huán)境因子進(jìn)行回歸，又稱多元直接梯度分析。主要用來反映菌群與環(huán)境因子之間的關(guān)系。RDA 是基于線性模型，CCA是基于單峰模型。分析可以檢測(cè)環(huán)境因子、樣品、菌群三者之間的關(guān)系或者兩兩之間的關(guān)系。 橫軸和縱軸：RDA 和CCA 分析，模型不同，橫縱坐標(biāo)上的刻度為每個(gè)樣品或者物種在與環(huán)境因子進(jìn)行回歸分析計(jì)算時(shí)產(chǎn)生的值，可以繪制于二維圖形中。圖例解讀：? 冗余分析可以基于所有樣品的OTU作圖，也可以基

15、于樣品中優(yōu)勢(shì)物種作圖；? 箭頭射線：圖11中的箭頭分別代表不同的環(huán)境因子（即圖中的碳酸氫根離子HCO3-，醋酸根離子AC-等，圖中的其它環(huán)境因子因研究不同代表的意義不同，因此不再贅述）；? 夾角：環(huán)境因子之間的夾角為銳角時(shí)表示兩個(gè)環(huán)境因子之間呈正相關(guān)關(guān)系，鈍角時(shí)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。環(huán)境因子的射線越長(zhǎng)，說明該影響因子的影響程度越大；? 圖11中不同顏色的點(diǎn)表示不同組別的樣品或者同一組別不同時(shí)期的樣品，圖中的拉丁文代表物種名稱，可以將關(guān)注的優(yōu)勢(shì)物種也納入圖中；? 環(huán)境因子數(shù)量要少于樣本數(shù)量，同時(shí)在分析時(shí)，需要提供環(huán)境因子的數(shù)據(jù)，比如 pH值，測(cè)定的溫度值等。9. 單樣品/ 多樣品分類學(xué)系統(tǒng)組成樹根據(jù)NC

16、BI 提供的已有微生物物種的分類學(xué)信息數(shù)據(jù)庫(kù)，將測(cè)序得到的物種豐度信息回歸至數(shù)據(jù)庫(kù)的分類學(xué)系統(tǒng)關(guān)系樹中，從整個(gè)分類系統(tǒng)上全面了解樣品中所有微生物的進(jìn)化關(guān)系和豐度差異。 單樣品圖（圖12）：可以了解單樣品中的序列在各個(gè)分類學(xué)水平上的分布情況。 圖例解讀：? 圖12中不同的層次反映不同的分類學(xué)水平；? 分支處的圓面積說明了分布在該分類學(xué)水平，且無法繼續(xù)往下級(jí)水平比對(duì)的序列數(shù)量，面積越大，說明此類序列越多；? 每個(gè)分支上的名詞后面的兩組數(shù)字分別表示比對(duì)到該分支上的序列數(shù)和駐留在該節(jié)點(diǎn)上的序列數(shù)；? 圖13中為某單一水平物種分布情況，并非是序列分布。 多樣品圖（圖14）：比對(duì)多個(gè)樣品在不同分類學(xué)分支上

17、序列數(shù)量差異。圖例解讀：? 比對(duì)不同樣品在某分支上的序列數(shù)量差異，通過帶顏色的餅狀圖呈現(xiàn)，餅狀圖的面積越大，說明在分支處的序列數(shù)量越多，不同的顏色代表不同的樣品。? 某顏色的扇形面積越大，說明在該分支上，其對(duì)應(yīng)樣品的序列數(shù)比其他樣品多。? 多樣品在做該分析時(shí)，建議樣品數(shù)量控制在10個(gè)以內(nèi)，或者將重復(fù)樣本數(shù)據(jù)合并成一個(gè)樣本后，總樣品數(shù)在10個(gè)以內(nèi)。10.系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹在分子進(jìn)化研究中，基于系統(tǒng)發(fā)生的推斷來揭示某一分類水平上序列間堿基的差異，進(jìn)而構(gòu)建進(jìn)化樹。 圖例解讀：? 圖15中體現(xiàn)的是序列進(jìn)化差異情況，處在同一分支上的物種說明進(jìn)化關(guān)系較近。? 圖15左下角的圖例為距離標(biāo)尺，分支距離越長(zhǎng)，進(jìn)化關(guān)

18、系越遠(yuǎn)。11. (un)Weighted UniFrac PCoA/Tree 分析利用各樣品序列間的進(jìn)化信息來計(jì)算樣品間距離，反映環(huán)境樣品在進(jìn)化樹中是否有顯著的微生物群落差異。PCoA（principal co-ordinates analysis）是一種研究數(shù)據(jù)相似性或差異性的可視化方法，通過一系列的特征值和特征向量進(jìn)行排序后，選擇主要排在前幾位的特征值，PCoA 可以找到 距離矩陣中最主要的坐標(biāo)，結(jié)果是數(shù)據(jù)矩陣的一個(gè)旋轉(zhuǎn)，它沒有改變樣品點(diǎn)之間的相互位置關(guān)系，只是改變了坐標(biāo)系統(tǒng)。通過PCoA 可以觀察個(gè)體或群體間的差異。 圖例解讀：? 圖16和圖17中不同顏色代表不同分組；? PCoA 分析建議不分組時(shí)，樣本數(shù)量不少于10 個(gè)；多組樣本時(shí)，每組樣本數(shù)量不少于5 個(gè)；? 對(duì)于某一功能基因，進(jìn)行進(jìn)化樹分析時(shí)，建議采用OTU數(shù)目控制在10,000以內(nèi)，或者由客戶指定分析優(yōu)勢(shì)OTU個(gè)數(shù)。12. NMDS 分析NMDS（Nonmetric Multidimensional Scaling）常用于比對(duì)樣本組之間的差異，可以基于進(jìn)化關(guān)系或數(shù)量距離矩陣。橫軸和縱軸：表示基于進(jìn)化或者數(shù)量距離矩陣的數(shù)值在二維表中成圖。 圖例解讀：? 圖18中不同的顏色代表不同的分組；? 建議不分組時(shí)，樣本數(shù)量不少于10個(gè)；多組樣本時(shí)，每組樣本數(shù)量不少于5個(gè)；? 圖18中的點(diǎn)