銀杏葉提取物對H2O2誘導的晶狀體上皮細胞Bcl2和Bax表達的影響

1、銀杏葉提取物對H2O2誘導的晶狀體上皮細胞Bcl-2和Bax表達的影響 作者：李爽樂，羅清禮，李正時，官鵬，盧燕，江愛華【摘要】 目的：觀察銀杏葉提取物（EGb761）對晶狀體上皮細胞凋亡相關基因蛋白Bcl-2和Bax表達的影響。方法：將離體培養(yǎng)的SD大鼠的晶狀體上皮細胞分成3組:實驗組用H2O2+EGb761處理，對照組用H2O2處理，空白對照組未做任何處理。用免疫組化的方法檢測上皮細胞Bcl-2，Bax的表達，分析實驗組、對照組和空白對照組的表達情況。 結果： Bcl-2蛋白表達的陽性細胞率:實驗組隨時間的延長而上升，24h時為(20.7±1.4)%，對照組則隨時間的延長而下降，

2、24h時為(2.6±0.6)%，空白對照組為(6.8±1.1)%；Bax蛋白表達的陽性細胞率：實驗組隨時間的延長無明顯變化，24h時為(10.7±0.9)%；對照組則隨時間的延長而上升，24h時為(33.4±4.6)%，空白對照組為(4.6±0.8)%。結論：EGb761通過使晶狀體上皮細胞Bcl-2蛋白表達增加，Bcl-2/Bax減少，阻止氧化損傷所致的晶狀體上皮細胞凋亡；細胞凋亡可能與白內障形成有關，EGb 761在早期白內障形成中可能起抑制作用。 【關鍵詞】 銀杏葉提取物 Bcl-2；Bax 氧化應激 晶狀體 上皮細胞 0引言 白內障的發(fā)

3、生與機體抗氧化損傷狀態(tài)有關，老年性白內障患者房水中H2O2含量高于正常1，氧化應激可能與老年性白內障有關。我們模擬老年性白內障患者房水中H2O2濃度處理Sprague-Dawley(SD)大鼠晶狀體上皮細胞，用免疫組化方法觀察晶狀體上皮細胞凋亡相關基因Bcl-2和Bax的表達情況，并通過銀杏葉提取物（EGb 761）對H2O2作用的晶狀體上皮細胞Bcl-2和Bax表達影響的對比觀察，旨在探討氧化應激與抗氧化劑對晶狀體上皮細胞凋亡的生物學行為之間的關系。 1材料和方法 1.1材料 CO2培養(yǎng)箱(美國)，超凈工作臺(蘇州)，體視顯微鏡(上海)，Olympus光學顯微鏡(日本)，各種培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿，

4、孵育濕盒等。無酚紅M199(Sigma)，按說明書配制成培養(yǎng)液，加入HEPES(Fluka) 25mmol/L，青霉素100kU/L,鏈霉素100kU/L，過濾、除菌、分裝，-20保存。用前加入Ginaton(德國舒培大藥廠，含EGb761 17.5g/ L)，葡萄糖氧化酶(Sigma)，300mL/L H2O2(上海，分析純)，葡萄糖(上海，分析純)，并調pH至7.27.4。0.01mol/L PBS pH7.6；0.5mol/L Tris/HCL pH7.6；羊血清 工作稀釋度(110)；雙蒸水；300ml/L H2O2；一抗鼠抗人Bcl-2單克隆抗體為Santa Cruz Biotech

5、nology 公司產(chǎn)品，4保存，工作稀釋度 (1100)；一抗羊抗人Bax抗體為Santa Cruz Biotechnology 公司產(chǎn)品，4保存，工作稀釋度(1100)； SP試劑盒為 ZYMED公司產(chǎn)品，4貯存，工作稀釋度(1100)； DAB 為Sigma公司產(chǎn)品。 1.2方法 四周齡SD大鼠，質量110±10g，雌雄兼用，無眼疾。購自華西醫(yī)科大學動物實驗中心。CO2吸入處死，摘取眼球，置于500kU/L青霉素生理鹽水中沖洗，在無菌條件下取透明晶狀體。將透明晶狀體放入含M199 1.5mL的24孔培養(yǎng)板中，置溫度37、95%濕度、50mL/L CO2培養(yǎng)箱中培育12h，備用。模

6、擬老年性白內障患者房水中H2O2濃度對離體培養(yǎng)SD大鼠晶狀體上皮細胞進行處理，分為H2O2 添加EGb761處理實驗組(以下簡稱實驗組)，H2O2處理對照組(以下簡稱對照組)，只有M199培養(yǎng)液的空白對照組(以下簡稱空白組)。在M199中加入0.95mmol/L葡萄糖、葡萄糖氧化酶1nkat、90mol/L H2O2?？墒笻2O2濃度在8h內維持于90±5mol/L。據(jù)文獻報道2,3：葡萄糖與葡萄糖氧化酶反應產(chǎn)生O2，由于O2的抽氫反應而生成H2O2。為保持較為恒定的H2O2濃度，每8h更換相同條件的培養(yǎng)基。取3個透明晶狀體為一組放入10cm大小，含M199 30mL培養(yǎng)皿中，置溫度

7、37，95%濕度、50mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)下述處理后，分別于3，6，18，24h時間段取培養(yǎng)晶狀體作指標測定。實驗組，在上述培養(yǎng)液中加入0.95mmol/L葡萄糖、葡萄糖氧化酶1nkat、100mg/L EGb761及90mol/L H2O2。對照組，在上述培養(yǎng)液中加入0.95mmol /L葡萄糖、葡萄糖氧化酶1nkat、90mol/ LH2O2。空白組，只在M199中培養(yǎng)。將培養(yǎng)3，6，18，24h的鼠晶狀體，沿赤道部完整剪下前囊，在體視顯微鏡下一分為二，細胞面向上平鋪于載玻片上，干燥后將鋪片置于4丙酮中固定10min，取出待自然干燥后放4冰箱保存?zhèn)溆?。蒸餾水浸洗丙酮固定玻片，0

8、.01mol/L PBS浸洗3min×3次；置30mL/L H2O2 水溶液中室溫10min，滅活內源性過氧化物酶活性；0.01mol/L PBS浸洗3min×3次；100mL/L正常羊血清封閉，3710min后棄去血清；滴加一抗(1:100工作稀釋度)室溫30min后置4冰箱過夜，0.01mol/L PBS浸洗3min×3次；滴加生物素標記的二抗(1:100)，371h， 0.01mol/L PBS浸洗3min×3次；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素(1:100)，371h，0.01mol/L PBS浸洗3min×3次；DAB顯色15min

9、；蘇木素復染；脫水，透明，封片。每次實驗以實驗室提供的Bcl-2、Bax表達陽性的組織切片為陽性對照；以PBS替代一抗作為陰性對照。細胞質內出現(xiàn)棕黃色顆粒為Bcl-2、Bax表達陽性細胞，細胞質無著色者為陰性細胞。細胞核均被染成蘭色。每組計算5張細胞鋪片，每張鋪片隨機選擇5個視野，在放大400倍顯微鏡下，計數(shù)1 000個細胞中的陽性細胞數(shù)，并計算陽性細胞率。 統(tǒng)計學處理：以SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對結果做統(tǒng)計學處理，用t檢驗對各組進行比較。 2結果 2.1 Bcl-2蛋白表達特征 空白對照組Bcl-2蛋白表達位于細胞質內，呈棕黃色顆粒，細胞核呈蘭色。陰性細胞細胞質不著色，僅見細胞核被染成蘭色

10、。在空白對照組晶狀體上皮細胞中有較少表達,平均為（6.8±1.1）%，（圖1）。EGb761在H2O2作用的早期(3h)并未引起實驗組Bcl-2蛋白表達明顯增加，其后隨著時間的延長，實驗組Bcl-2蛋白表達逐漸增加(圖1，2)。對照組在H2O2作用的早期表現(xiàn)出Bcl-2蛋白表達增加的趨勢，隨后明顯下降(圖1，3)。 2.2 Bax蛋白表達特征 空白對照組Bax蛋白表達位于細胞質內，呈棕黃色顆粒，細胞核呈蘭色。陰性細胞細胞質不著色，僅見細胞核被染成蘭色?？瞻讓φ战M晶狀體上皮細胞中表達極少或未見表達，平均為（4.6±0.8）%(圖2)。EGb761作用于H2O2處理的實驗組，在

11、24h內，Bax蛋白表達未見明顯變化，對照組隨著培養(yǎng)時間的延長，Bax蛋白表達顯著增加(圖4，5)。 3討論 原癌基因bcl- 2是抑制細胞凋亡(apoptosis)途徑中的一個重要基因，bcl-2通過抗氧化的途徑阻止細胞發(fā)生凋亡2-6。bcl- 2能對抗H2O2誘導的細胞液鈣濃度升高和繼發(fā)的谷胱苷肽還原系統(tǒng)功能損害而引起的細胞死亡7-9。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗氧化劑如壞血酸能通過增加bcl-2表達而減少細胞凋亡的發(fā)生，但氧化應激誘導劑引起細胞增殖或凋亡與bcl-2功能關系尚未完全明了10。我們的實驗結果顯示：對照組在H2O2作用的早期Bcl-2蛋白表達增加，是否晶狀體上皮細胞自身抗氧化防御機制對氧化應激

12、的反應，有待進一步實驗證實。bax 基因與bcl-2基因有21%的同源性，bax具有促進細胞凋亡發(fā)生的作用，氧化應激誘導Bax表達增加，并通過使Bcl-2 水平下降，引起繼之而發(fā)生的細胞凋亡。Bax可與Bcl-2形成同源或異源二聚體，細胞內Bax和Bcl-2的量決定了Bcl-2/Bax和Bax/Bax二聚體的比例，而這一比例又決定了細胞對凋亡信號的易感性，調節(jié)細胞死亡和存活的平衡狀態(tài)11。已有實驗證實，機體的抗氧化防御機制如谷胱苷肽還原系統(tǒng)能力的提高可減少bax表達所引起的細胞凋亡的發(fā)生，可知氧化還原的動態(tài)平衡在維持細胞生存中起著必不可少的重要作用12。在我們的實驗中發(fā)現(xiàn)，對照組在H2O2作用

13、的早期引起B(yǎng)cl-2蛋白表達增加，隨后出現(xiàn)Bcl-2表達明顯下降，Bax表達顯著增加以及Bcl-2 /Bax比例下降，可能與對照組晶狀體上皮細胞凋亡率高于實驗組有關。 我們的實驗結果顯示，EGb761作用于H2O2處理的晶狀體上皮細胞，在作用的早期(培養(yǎng)3h)并未引起顯著的Bcl-2表達增加，據(jù)此可推測EGb761啟動或提高晶狀體上皮細胞自身的抗氧化防御機制保護細胞免受氧化損傷先于引起B(yǎng)cl-2表達增加。EGb761可能減輕了H2O2對晶狀體上皮細胞的氧化應激作用，維持了晶狀體上皮細胞在高H2O2環(huán)境中氧化還原的動態(tài)平衡。雖然在整個培養(yǎng)期中Bax表達無明顯變化，但隨著培養(yǎng)時間的延長，實驗組Bc

14、l-2表達陽性細胞率逐漸增加，Bcl-2 /Bax比例逐漸提高，即EGb761通過提高Bcl-2表達而非降低Bax表達水平，表現(xiàn)出抗氧化損傷所致的細胞凋亡。與文獻報道相一致11。而過氧化氫處理對照組在H2O2作用的早期引起B(yǎng)cl-2表達增加，隨后出現(xiàn)Bcl-2表達明顯下降，Bax表達顯著增加以及Bcl-2 /Bax比例下降，并由此而致細胞凋亡的發(fā)生。而Bax與氧化應激在白內障發(fā)生中的確切關系有待進一步研究?！緟⒖嘉墨I】 1 Spector A, Garner WH. Hydrogen peroxide and human cataract. Exp Eye Res, 1981;33(6):67

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