革蘭氏染色法的過程及原理

1、革蘭氏染色法的過程及原理 一，過程1 涂片將培養(yǎng)的不同菌分別作涂片(注意涂片切不可過于濃厚)，干燥、固定。固定時 通過火焰I 一2次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。2 .染色(1)初染加草酸鉸結(jié)晶紫一滴，約一分鐘，水洗。(2 )媒染滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗。(3 )脫色將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用95 %酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時為止，約 20 一 30秒鐘，立即用水沖凈酒精。(4 )復(fù)染用番紅液染1 一 2分鐘，水洗。(5 )鏡檢干燥后，置油鏡觀察.革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。 以分散開的細菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準，過于密集的細菌，常常呈假陽性。

2、(6 )同法在一載玻片上以大腸桿菌與枯草芽抱桿菌混合制片，作革蘭氏染色對 比。二，原理革蘭氏染色法(Gram stain )不僅能觀察到細菌的形態(tài)而且還可將所有細菌區(qū) 分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌，用G+表示：染色反應(yīng)呈紅色(復(fù)染顏色)的稱為革蘭氏陰性細菌，用G 一表示。細菌對于革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。革蘭氏陽性細菌 的細胞壁主要是由膚聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的，在染色過程中，當用乙醇處理時，由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小， 通透性降低，使結(jié)晶紫一碘復(fù)合物 被保留在細胞內(nèi)而不易脫色，因此，呈現(xiàn)藍紫色；革蘭氏陰性細菌的細胞壁中膚 聚糖

3、含量低，而脂類物質(zhì)含量高，當用乙醇處理時，脂類物質(zhì)溶解，細胞壁的通 透性增加，使結(jié)晶紫一碘復(fù)合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復(fù)染液(番 紅)的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴格掌握酒精脫色程度， 如脫色過度，則陽性菌可被誤染 為陰性菌：而脫色，不夠時，陰性菌可被誤染為陽性菌。此外，菌齡也影響染色 結(jié)果，如陽性菌培養(yǎng)時間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應(yīng)。青霉素作用機制干擾細菌細胞壁的合成。青霉素你的結(jié)果與細胞壁的成分粘肽結(jié)構(gòu)中德D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可與后者競爭轉(zhuǎn)肽酶，阻礙你粘肽的形成，造成細胞壁的缺 損，使細菌失去細胞壁的滲透屏障，對細菌起到殺滅作用。溶菌

4、酶與青霉素對細菌細胞壁的作用 溶菌酶作用機制：是一種能水解致病菌種黏 多糖的堿性酶，只要通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的 B-1，4糖苷鍵，使細胞壁不溶性黏多糖分 解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細胞壁破裂內(nèi)容物流 出而使細菌溶解，溶菌酶還可以和帶負電荷 的病毒蛋白直接結(jié)合，與 DNA RNA脫輔 基蛋白形成復(fù)鹽，使病毒失活，因此該酶具 有抗菌消炎，抗病毒等作用 判斷細菌有無鞭毛的方法電鏡觀察，鞭毛染色，半固體穿刺培養(yǎng)，菌落形態(tài)觀察描述細菌與古細菌在細胞膜上的主要化學區(qū)別在革蘭氏陰性菌的表層，有由肽葡聚糖形成的細胞壁，在壁的外面，又有由蛋白質(zhì)、磷脂質(zhì)、脂多糖形成 的膜層，與里面的

5、細胞質(zhì)膜相對應(yīng)，特稱此層為細菌外膜。外膜比細胞質(zhì)膜的磷脂質(zhì)含量低，但脂多糖的 含量則比較高。外膜的蛋白質(zhì)與細胞質(zhì)膜不同，主要部分為數(shù)種蛋白質(zhì)所構(gòu)成。其主要蛋白質(zhì)的部分與特 異的內(nèi)面的肽葡聚糖以共價鍵結(jié)合。脂多糖存在于外膜的最外層。在外膜中僅知有磷脂酶，在細胞與外界 的聯(lián)系中，已看到有許多功能的蛋白質(zhì)，即有各種噬菌體、維生素B12、大腸桿菌素等的受體存在，而其一部分蛋白質(zhì)則與 DNA的復(fù)制、細胞分裂有關(guān)，此外，外膜對水溶性低分子物質(zhì)容易透過，但對抗菌物質(zhì) 則是透過的屏障，它對革蘭氏陰性菌間的透過性帶來很大的差異。對于古細菌來說，細胞壁不含肽聚糖，有的以蛋白質(zhì)為主，有的含雜多糖，有的類似于肽聚糖，

6、但都不含 胞壁酸、D型氨基酸和二氨基庚二酸。缺乏細胞壁的原核生物， 除了自然界天然存在的缺壁細胞，比如支原體外，實驗室菌種的突變、人為抑制新細胞壁合成、和對現(xiàn)成細胞壁進行酶解都可以得到缺壁細胞。缺壁細胞主要有四類：L型細菌，原生質(zhì)體，球狀體，以及支原體。L型細菌；形成；實驗室或宿主體內(nèi)通過自發(fā)性突變而形成的遺傳性穩(wěn)定的細胞壁缺陷菌株特點；細胞膨大，對滲透敏感，在培養(yǎng)基上可形成油煎蛋狀菌落，具有正常的繁殖能力實踐意義；沒有了細胞壁的機械固定，細胞及其柔韌，呈多樣性，成為“濾過型細菌”。原生質(zhì)體，球狀體;形成；用溶菌酶除盡原有的細胞壁，再用青霉素抑制新生細胞壁的合成，最后得到一層僅有細胞膜包裹的圓

7、球狀滲透敏感細胞特點；無完整的細胞壁，細胞呈球狀，對滲透壓極其敏感， 革蘭氏染色陰性，細胞不能分裂， 對相應(yīng)噬菌體不敏感，無繁殖能力實踐意義；比正常有細胞壁的細菌更容易導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)，是研究遺傳規(guī)律和進行原生質(zhì)體融合育種的良好材料支原體；形成；在長期進化中形成，適應(yīng)自然生活條件特點；細胞膜中含有甾醇，故機械強度較大實踐意義；青霉素等針對細胞壁殺傷的抗生物對其無效，但是抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素（四環(huán)素，紅霉素等）和破壞含甾醇細胞膜結(jié)構(gòu)的抗生素（制霉菌素，兩性霉素等）對其有效。僅供個人用于學習、研究；不得用于商業(yè)用途For personal use only in study and resear

8、ch; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerzielieiwecken verwendet werden.Pour l ' e tude et la recherche uniquementa des fins personnelles; pasa des fins commerciales.to員bko gA.nrogeHKO TOpMenob3ymrnflCH6yHeHuac egoB u HHuefigoHMucno 員 B30BaTbCEb KOMMepqeckuxqe 員 ex.僅供個人用于學習、研究；不得用于商業(yè)用途For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zweckenerwendet werden.Pour l ' e tude et la recherche uniquementa des fins pe