四川生物選修一考查知識點(diǎn)

1、生物選修一 7個實(shí)驗(yàn) 相關(guān)知識點(diǎn) 課題果酒和果醋的制作一、果酒制作的原理1.制作果酒的菌種果酒制作的菌種是酵母菌,新陳代謝類型兼性厭氧型。酶2.制作果酒的原理酶酵母菌有氧時,呼吸的反應(yīng)式為:C6H12O6+6H2O+6O26CO2+12H2O; 無氧時,呼吸的反應(yīng)式為: C6H12O62C2H5OH+2CO2。3.發(fā)酵的溫度條件酵母菌繁殖最適溫度20 ,酒精發(fā)酵一般控制在1825 。 4.葡萄酒發(fā)酵的菌種來源在葡萄酒的自然發(fā)酵過程中,起主要作用的是附著在葡萄皮上的野生型酵母菌。二、果醋制作的原理1.制作果醋的菌種制作果醋的菌種是醋酸菌,屬于好氧菌,新陳代謝類型為異養(yǎng)需氧型。對氧氣的含

2、量特別敏感。2.醋酸菌最適溫度條件:最適合溫度為3035 ,需要充足的氧氣。 3.果醋制作原理在氧氣、糖源充足時 ,醋酸菌將糖分解形成醋酸;當(dāng)缺少糖源時可將乙醇轉(zhuǎn)變成乙醛,并進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成醋酸。醋酸發(fā)酵的反應(yīng)式是:C2H5OH+O2CH3COOH+H2O。三、制作果酒、果醋的實(shí)驗(yàn)流程示意圖挑選葡萄沖洗榨汁酒精發(fā)酵醋酸發(fā)酵 果酒果醋四、操作過程應(yīng)注意的問題1.為防止發(fā)酵液被污染,發(fā)酵瓶要用體積分?jǐn)?shù)70%的酒精消毒。2.葡萄汁裝入發(fā)酵瓶時,要留出大約1/3的空間。3.制作葡萄酒時將溫度嚴(yán)格控制在1825 ,時間控制在1012 d左右,可通過出料口對發(fā)酵的情況進(jìn)行及時的監(jiān)測。 4.

3、制葡萄醋的過程中,將溫度嚴(yán)格控制在30 35 ,時間控制在78 d,并注意適時通過充氣口充氣。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評價可通過嗅覺和品嘗初步鑒定,并用重鉻酸鉀檢驗(yàn)酒精存在。其原理是在酸性條件下,重鉻酸鉀與酒精反應(yīng)呈現(xiàn)灰綠色。疑難解答（1）你認(rèn)為應(yīng)該先沖洗葡萄還是先除去枝梗？為什么？應(yīng)該先沖洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗時引起葡萄破損，增加被雜菌污染的機(jī)會。（2）你認(rèn)為應(yīng)該從哪些方面防止發(fā)酵液被污染？如：要先沖洗葡萄，再除去枝梗；榨汁機(jī)、發(fā)酵裝置要清洗干凈，并進(jìn)行酒精消毒；每次排氣時只需擰松瓶蓋，不要完全揭開瓶蓋等。（3）制葡萄酒時，為什么要將溫度控制在1825？制葡萄醋時，為什么要將溫度控制在

4、3035？溫度是酵母菌生長和發(fā)酵的重要條件。20左右最適合酵母菌的繁殖。因此需要將溫度控制在其最適溫度范圍內(nèi)。而醋酸菌是嗜溫菌，最適生長溫度為3035，因此要將溫度控制在3035。課題微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)一、培養(yǎng)基和無菌技術(shù)1.培養(yǎng)基的概念人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求,配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)叫培養(yǎng)基?？煞譃楣腆w培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。2.培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成各種培養(yǎng)基一般都含有水、碳源、氮源和無機(jī)鹽,此外還要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。 3.培養(yǎng)基舉例培養(yǎng)乳酸桿菌時需在培養(yǎng)基中添加維生素、培養(yǎng)霉菌時需將培養(yǎng)基的pH調(diào)至酸性、培養(yǎng)細(xì)菌時需將pH調(diào)至中性或微堿性、培養(yǎng)厭氧微

5、生物則需提供無氧的條件。4.無菌技術(shù)的內(nèi)容(1)對實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒 ;(2)將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌;(3)為避免周圍環(huán)境中微生物的污染,實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行;(4)實(shí)驗(yàn)操作時應(yīng)避免已滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。5.消毒與滅菌的概念消毒是指使用較溫和的物理或化學(xué)方法殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。6.消毒方法(1)日常生活經(jīng)常用到的是煮沸消毒法;(2)對一些不耐高溫的液體,則使用巴氏消毒法;(3)實(shí)驗(yàn)操作者的雙手使用酒精進(jìn)行消毒;(4)飲水水源用氯氣進(jìn)行消毒。7.滅菌方法(1)接種環(huán)、接種針等使用灼

6、燒滅菌法;(2)玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法,所用器械是干熱滅菌箱;(3)培養(yǎng)基等使用高壓蒸汽滅菌法,所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋;(4)表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法,所用器械是紫外燈。二、制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.計(jì)算根據(jù)配方比例,計(jì)算配制100 mL培養(yǎng)基各成分用量。2.稱量準(zhǔn)確稱取各成分。稱取牛肉膏和蛋白胨時動作要迅速,目的是防止牛肉膏吸收空氣中水分 。3.溶化加水加熱溶化牛肉膏;加入蛋白胨和氯化鈉繼續(xù)加熱使其溶解;加入瓊脂熔化后用蒸餾水定容到1 000 mL。整個過程不斷用玻璃棒攪拌,目的是防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。4.滅菌將配制好的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到錐形瓶中,加棉塞包扎后用

7、高壓滅菌鍋滅菌;所用培養(yǎng)皿用報紙包扎后用干熱滅菌箱滅菌。5.倒平板待培養(yǎng)基冷卻至50 左右時在酒精燈火焰附近倒平板。 其過程是:在火焰旁右手拿錐形瓶,左手拔出棉塞;右手拿錐形瓶,使錐形瓶的瓶口迅速通過火焰;左手將培養(yǎng)皿打開一條縫隙,右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿,立即蓋上皿蓋;待平板冷卻凝固后,將平板倒過來放置。倒平板操作的討論1. 培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？ 提示：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進(jìn)行倒平板了。2. 為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？ 答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培

8、養(yǎng)基。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。4. 在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？ 答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。三、純化大腸桿菌1.平板劃線法的概念平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基的表面連續(xù)劃線的操作,將 聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。 2.平板劃線法的操作步驟將接種環(huán)放在酒精燈火焰上灼燒

9、直至燒紅。在酒精燈火焰旁冷卻接種環(huán),并打開盛有菌液的試管的棉塞。將菌種試管口通過火焰達(dá)到消滅試管口雜菌的目的。將已冷卻的接種環(huán)伸入到菌液中沾取一環(huán)菌液。將菌種試管口再次通過火焰后塞上棉塞。將皿蓋打開一條縫隙,把接種環(huán)伸入平板內(nèi)劃35條平行線,蓋上皿蓋,注意不要劃破培養(yǎng)基。灼燒接種環(huán),冷卻后從第一區(qū)域劃線末端開始向第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)上述過程,完成三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將第五區(qū)域內(nèi)的劃線與第一區(qū)域劃線相連。將平板倒置放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。平板劃線操作的討論1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避

10、免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得

11、到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。3.稀釋涂布平板法的概念將菌液進(jìn)行一系列梯度稀釋,并將不同稀釋度菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)稀釋度足夠高時,即可獲得單個細(xì)菌形成的標(biāo)準(zhǔn)菌落。4.系列稀釋操作取盛有9 mL水的無菌試管6支,并編號101、102、103、104、105、106。用移液管吸取1 mL菌液注入編號為101的試管中,使之與水混勻。從101倍稀釋液中吸取1 mL菌液注入到編號為102的試管使之均勻。依此類推,直到完成最后一支試管的稀釋。5.菌種的保存對于頻繁使用的菌種,可以采用臨時保藏的方法。對于需要長期保存的菌種,可以采用甘油管藏的方法。課題土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

12、一、研究思路1.課題背景尿素是一種重要的氮肥,農(nóng)作物不能(填“能”或“不能”)直接吸收利用,而是首先通過土壤中的細(xì)菌將尿素分解為氨 ,這是因?yàn)榧?xì)菌能合成脲酶。2.篩選菌株科學(xué)家能從熱泉中把耐熱細(xì)菌篩選出來是因?yàn)闊崛母邷貤l件淘汰了絕大多數(shù)微生物,這樣也適用于實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選,原理是人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等),同時抑制或阻止其他微生物生長。3.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目在統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目時,常用來統(tǒng)計(jì)樣品中活菌數(shù)目的方法是稀釋涂布平板法。除此之外,顯微鏡直接計(jì)數(shù)也是測定微生物數(shù)量的常用方法。采用稀釋涂布平板法統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目時,培養(yǎng)基表面生長的一個菌落,來源于樣品稀釋液中一個活菌。

13、通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù),就能推測出樣品中大約含有多少活菌。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確,一般選擇菌落數(shù)在30300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。4.設(shè)置對照設(shè)置對照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。對照實(shí)驗(yàn)是指除了被測試的條件外,其他條件都相同的實(shí)驗(yàn)。滿足該條件的稱為對照組,未滿足該條件的稱為實(shí)驗(yàn)組。二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的內(nèi)容實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括實(shí)驗(yàn)方案、所需儀器、材料、用具和藥品,具體實(shí)施步驟和時間安排等。2.土壤中的微生物土壤中的微生物主要分布在距地表38 cm的近中性土壤中,約70%90%為細(xì)菌。3.樣品的稀釋因?yàn)椴煌⑸镌谕寥乐泻坎煌?為保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適

14、于計(jì)數(shù)的平板。細(xì)菌稀釋度為104、105、106,放線菌稀釋度為103、104、105,真菌稀釋度為102、103、104。4.微生物的培養(yǎng)與觀察不同種類的微生物往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。細(xì)菌一般在3037 培養(yǎng)12 d,放線菌一般在2528 培養(yǎng)57 d,霉菌一般在2528的溫度下培養(yǎng)34 d。5.在菌落計(jì)數(shù)時,每隔24 h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果,以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。6.菌落的特征: 菌落的特征包括形狀、大小、隆起程度、顏色等方面。疑難解答（1）如何從平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)？統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計(jì)3

15、個平板，計(jì)算出平板菌落數(shù)的平均值每克樣品中的菌落數(shù)=（C/V）*M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積（ml），M代表稀釋倍數(shù)三、操作提示和結(jié)果分析與評價1.操作提示(1)取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的信封在使用前都要滅菌。(2)應(yīng)在火焰旁稱取土壤10 g。將稱好的土樣倒入盛有90 mL無菌水的錐形瓶中,塞好棉塞。(3)在稀釋土壤溶液的過程中,每一步都要在火焰旁進(jìn)行。(4)實(shí)驗(yàn)時要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、稀釋度等。(5)為了提高效率,在操作時更加有條不紊,應(yīng)當(dāng)事先規(guī)劃時間。2.結(jié)果分析與評價(1)對分離的菌種作進(jìn)一步的鑒定,還需要

16、借助生物化學(xué)的方法。(2)在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中,細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成了氨 。氨會使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng) ,pH升高 。因此,我們可以通過檢測培養(yǎng)基pH變化來判斷該化學(xué)反應(yīng)是否發(fā)生。(3)在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后,如果pH升高,指示劑將變紅,說明該細(xì)菌能夠分解尿素。課題菊花的組織培養(yǎng)一、植物組織培養(yǎng)的過程1.細(xì)胞分化在植物的個體發(fā)育中細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能上出現(xiàn)穩(wěn)定性差異的過程。2.愈傷組織愈傷組織是通過細(xì)胞分裂形成的,細(xì)胞排列疏松而無規(guī)則,高度液泡化呈無定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。3.脫分化由高度分化的植物組織或細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織的過程稱為植物細(xì)胞的脫分化,

17、或者叫去分化。4.再分化脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng),可以重新分化成根或芽等器官的過程叫再分化。二、影響植物組織培養(yǎng)的因素1.植物材料的選擇植物的種類、材料的年齡和保存時間的長短等都會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。菊花組織培養(yǎng)一般選擇未開花植株的莖上部新萌生的側(cè)枝。2.營養(yǎng)常用的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基,其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg,微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co,有機(jī)物有甘氨酸、煙酸、肌醇、維生素、蔗糖等。3.激素在培養(yǎng)基中需要添加生長素和細(xì)胞分裂素等植物激素,其濃度、使用的先后順序、用量的比例等都影響結(jié)果。4.環(huán)境條件pH、溫度、光照等環(huán)境條件也影響植物的組織培養(yǎng)。菊

18、花組培所需pH為5.8,溫度為1822 ,光照條件為每日用日光燈照射12小時。 三.實(shí)驗(yàn)操作1.制備MS固體培養(yǎng)基(1)配制各種母液:將各種成分按配方比例配制成濃縮液。使用時根據(jù)母液的濃縮倍數(shù),計(jì)算用量,并加蒸餾水稀釋。(2)配制培養(yǎng)基:應(yīng)加入的物質(zhì)有瓊脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有機(jī)物和植物激素的母液,并用蒸餾水定容到 1 000 毫升。在菊花組織培養(yǎng)中,可以不添加植物激素,原因是菊花莖段組織培養(yǎng)比較容易。(3)滅菌:采取的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌。2.外植體消毒3.接種、培養(yǎng)、移栽和栽培(1)前期準(zhǔn)備:用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精消毒工作臺,點(diǎn)燃酒精燈。注意所有接種工作都必須在酒精燈

19、旁進(jìn)行,器械使用前后都要用火焰灼燒滅菌。(2)接種操作:接種過程中插入外植體時形態(tài)學(xué)上端朝上,每個錐形瓶接種68塊外植體。(3)培養(yǎng)過程應(yīng)該放在無菌箱中進(jìn)行,并定期進(jìn)行消毒,保持適宜的溫度和光照。(4)移栽前應(yīng)先打開培養(yǎng)瓶的封口膜,讓其在培養(yǎng)間生長幾日,然后用流水清洗根部培養(yǎng)基。然后將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境下生活一段時間,進(jìn)行壯苗。最后進(jìn)行露天栽培。課題果膠酶在果汁生產(chǎn)中的作用一、果膠與果膠酶1.果膠的作用及成分:果膠是植物細(xì)胞壁及胞間層的主要成分之一,它是由半乳糖醛酸聚合而成的一種高分子化合物,不溶于水。2.果膠酶的作用:果膠酶能夠把果膠分解成可溶性的半乳糖醛酸。3.果膠酶的組

20、成:果膠酶是分解果膠的一類酶的總稱,包括多聚半乳糖醛酸酶、果膠分解酶和果膠酯酶等。4.果膠酶的來源:植物、霉菌、酵母菌和細(xì)菌均能產(chǎn)生果膠酶。由霉菌發(fā)酵生產(chǎn)的果膠酶是食品加工業(yè)中使用量最大的酶制劑之一,被廣泛地應(yīng)用于果汁加工業(yè)。二、酶的活性與影響酶活性的因素1.酶的活性是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力,酶活性的高低可用一定條件下,酶所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度來表示。2.酶的反應(yīng)速度是指單位時間內(nèi)、單位體積中反應(yīng)物的減少量或產(chǎn)物的增加量。3.影響酶活性的條件有溫度、pH和酶的抑制劑等。三、探究溫度和pH對酶活性的影響1.在一恒定溫度下,通過設(shè)置pH梯度來確定酶催化反應(yīng)的最適pH,在一恒定的pH下,

21、通過設(shè)置溫度梯度來確定酶催化反應(yīng)的最適溫度。2.在研究溫度和pH對唾液淀粉酶活性的影響時,通過用碘液檢測反應(yīng)后的溶液是否變藍(lán)來判斷酶是否有活性,本課題的要求更進(jìn)一步,需要定量測定果膠酶的活性。3.在測定果膠酶的活性時,可以通過測定果汁體積來判斷果膠酶活性的高低,獲得的蘋果汁越多,說明果膠酶的活性越高。四、探究果膠酶的用量1.生產(chǎn)果汁時,為了使果膠酶得到充分的利用,節(jié)約成本,需要控制好酶的用量。2.該實(shí)驗(yàn)是在探究了果膠酶的最適溫度和最適pH之后進(jìn)行的,實(shí)驗(yàn)的變量不再是pH或溫度,而是酶的用量。在這個實(shí)驗(yàn)中,除了酶的用量以外,影響果汁產(chǎn)量的因素還有:pH、溫度、酶催化反應(yīng)的時間、蘋果泥的用量等。課

22、題血紅蛋白的提取和分離一、凝膠色譜法 1.概念:也稱做分配色譜法;是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。2.原理(1)由多糖類化合物構(gòu)成的凝膠,內(nèi)部有許多貫穿的通道。(2)當(dāng)相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時,相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道,路程較長,移動速度較慢,而相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道,只能在凝膠外部移動,路程較短,移動速度較快,從而使相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子得以分離。二、緩沖溶液1.作用:在一定范圍內(nèi),緩沖溶液能抵制外界的酸和堿對溶液pH的影響,維持pH基本不變。2.配制:由12種緩沖劑溶解于水中配制而成,通過調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以

23、得到在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。三、電泳 1.概念:指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。2.原理:在一定的pH下,多肽、核酸等生物大分子的可解離基團(tuán)會帶上正電或負(fù)電,在電場的作用下,這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。3.作用:電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異及分子本身的大小、形狀的不同,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。4.方法:常用的電泳方法有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量時通常使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。四、實(shí)驗(yàn)操作1.樣品處理:通過紅細(xì)胞的洗滌、血紅蛋白的釋放、分離血紅蛋白溶液等操作收集血紅蛋白溶液。(

24、1)紅細(xì)胞的洗滌:目的是去除雜蛋白。分離時采用低速短時間離心,直至上清液中沒有黃色,表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。(2)血紅蛋白的釋放:在蒸餾水和甲苯的作用下,紅細(xì)胞破裂,釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液:把攪拌好的混合液離心后,將試管中的液體用濾紙過濾、除去脂溶性沉淀層,于分液漏斗中靜置片刻后,分離出下層的紅色透明液體。2.粗分離:即透析(1)方法:將血紅蛋白溶液裝入透析袋,將透析袋放入一定量適宜濃度的磷酸緩沖液中,透析12 h。(2)目的:將樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)除去。(3)原理:透析袋能使小分子自由進(jìn)出,而將大分子保留在袋內(nèi)。3.純化:通過凝膠色譜柱將相對分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去。

25、操作如下:(1)凝膠色譜柱的制作(2)凝膠色譜柱的裝填材料:本實(shí)驗(yàn)使用的是交聯(lián)葡聚糖凝膠。方法:凝膠用蒸餾水充分溶脹后,配成凝膠懸浮液,一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)。不能有氣泡存在,不能發(fā)生洗脫液流干露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。(3)樣品的加入和洗脫a.準(zhǔn)備:加樣前,打開流出口,使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊,關(guān)閉出口。b.加樣:用吸管小心地將1 mL透析后的樣品加到色譜柱的頂端,注意不要破壞凝膠面。c.加樣后:打開下端出口,使樣品滲入凝膠床內(nèi)。洗脫:加入緩沖液,打開下端出口,進(jìn)行洗脫。4.純度鑒定:在鑒定的方法中,使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。五、操作提示1.紅細(xì)胞的洗滌:洗滌次數(shù)、離心速度與離心時間十分重要。洗滌次數(shù)過少,無法除去血漿蛋白;離心速度過高和時間過長會使白細(xì)胞等一同沉淀,達(dá)不到分離效果。2.色譜柱填料的處理:商品凝膠使用前需直接放在洗脫液中膨脹,可以將加入其中的濕凝膠用沸水浴加熱,加速膨脹。3.凝膠色譜柱的裝填:在裝填凝膠柱時,不得有氣泡存在。氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序,降