小鼠腹水型肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移實驗

1、小鼠腹水型肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移實驗摘要 目的:1. 通過可移植性小鼠腹水型肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移實驗， 從感 性上認識腫瘤侵襲與淋巴道轉(zhuǎn)移的生物學特性， 了解腫瘤動物實驗?zāi)?型建立的過程及意義。 2. 進一步了解動物尸體解剖、組織取材、染色 的過程。 3.強化科研思維的培養(yǎng)及實驗技能的訓練。方法:將高轉(zhuǎn)移力小鼠腹水型肝癌細胞 (HCa - F) 經(jīng) 615 小鼠右腋中 線皮下接種， 定期觀察右腋皮下腫瘤的生長和同側(cè)腋窩淋巴結(jié)及腹 股溝淋巴結(jié)腫大情況， 并于接種后 21 天處死全部小鼠， 取皮下瘤體 及雙側(cè)腋窩淋巴結(jié)， 腹股溝淋巴結(jié)稱重并測量大小， 同時觀察腫瘤的 形態(tài)特點，生長方式，肺、肝、腎等臟器，并將瘤

2、體、淋巴結(jié)及臟器 做切片處理以作染色和鏡下觀察。結(jié)果 :21 天 觀察，實驗使用 10 只小鼠，最終存活 8 只，其中形成 腫塊 7 只（3 只形成的腫 塊較大），成瘤率 70%，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率 70%。肉眼觀察， 較大腫瘤 2*1.5*1.3cm ，灰白色，質(zhì)地較硬，從中間切開， 發(fā)現(xiàn)腫塊大部分壞死，中心部分出現(xiàn)腔，腔內(nèi)有腫瘤壞死物質(zhì)。鏡下 觀察，壞死組織粉染，輪廓尚存。殘存腫瘤組織細胞存在異型性：瘤 細胞大小和形態(tài)不一致， 細胞核體積增大并呈現(xiàn)多形性， 核漿比增大。核的大小、形狀和染色不一。 核分裂象增多， 核漿比失調(diào)， 胞漿減少。結(jié)論: 高轉(zhuǎn)移力小鼠腹水型肝癌細胞通過淋巴道轉(zhuǎn)移，無器官轉(zhuǎn)移

3、， 且具有高轉(zhuǎn)移力。關(guān)鍵詞HCa-F （高轉(zhuǎn)移力小鼠腹水型肝癌細胞）;615小鼠；高淋巴道轉(zhuǎn)移 前言 研究背景 : 原發(fā)性肝癌的發(fā)生率地區(qū)差異大，在亞非國家較常 見，我國的發(fā)病率較高，屬于常見的腫瘤之一。近年來，我國對肝癌 的防治研究取得了明顯的成績，一些直徑在1cm 一下的小肝癌已被發(fā) 現(xiàn)并及時治療取得滿意的療效 1 。隨著臨床治療經(jīng)驗的積累，逐漸 意識到即使是小肝癌根治性切除， 轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)仍然是一個十分嚴峻的問 題，術(shù)后 5 年復(fù)發(fā)率可高達 50% 。存在的問題 :本次試驗采用的方法是將瘤細胞移植于 615 小鼠右腋中線皮下，觀察腫瘤生長及轉(zhuǎn)移狀態(tài)刁。所以移植瘤沒有展現(xiàn)自發(fā)性腫瘤從正常組織轉(zhuǎn)

4、變成腫瘤、隨后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的全過程，沒有了解疾病完整的自然史。實驗的意義：為了探究肝癌的實質(zhì)性問題，即腫瘤本身的生物學特性, 尤其是其轉(zhuǎn)移的生物學特性，本次試驗對肝癌轉(zhuǎn)移的生物學行為進行實驗性研究。即將腫瘤細胞直接接種到小鼠的皮下組織然后觀察腫 瘤細胞在小鼠體內(nèi)的生長及轉(zhuǎn)移情況。它基本上模擬了從腫瘤生長到 轉(zhuǎn)移瘤形成的一系列步驟，又涉及宿主的反應(yīng)性，因此結(jié)果可靠，近 似于臨床病人的實際情況，對提高惡性腫瘤患者的生存率和預(yù)后有重 要的意義3。正文、材料1、細胞系：高轉(zhuǎn)移力小鼠腹水型肝癌細胞，由大連醫(yī)科大學病理教研室建株并保存。2、實驗動物：近交系615小鼠，雌雄兼用，6-8周齡，體重18-22g,由

5、大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供。3、主要試劑及器皿 搪瓷盆、溫度計、離心管、1ml注射器、手術(shù) 刀、眼科手術(shù)剪、眼科手術(shù)鑷、乳膠手套、生理鹽水、1淙蘇兒溶液、75%酉精棉、10%甲醛固定液等。二、方法1、細胞系獲取從液氮罐中取出高轉(zhuǎn)移力小鼠腹水型肝癌細胞(Hca-F)塑料冷凍管，立即放入40攝氏度的溫水中，1分鐘內(nèi)是冷凍液全部融化，立即送入無菌室。取出細胞懸液放入離心管中，用生理鹽水洗滌2次，離心，棄上清，再加1ml生理鹽水吹打均勻。向小鼠腹腔內(nèi)接種0.2mlHCa-F細胞懸液，于第6天無菌條件去腹水。2、615小鼠皮下接種腫瘤細胞取615小鼠癌性腹水0.1ml，內(nèi)含2*106個活瘤細胞，接種于

6、615小鼠右腋中線皮下。局部嚴格消毒。選擇右腋皮下接種。定期檢查右腋皮下腫瘤生長和同側(cè)腋窩淋巴結(jié)及腹股溝淋巴結(jié)腫大情況，于接種后21天處死全部小鼠，取皮下瘤體及雙側(cè)淋巴結(jié)稱重，同時觀察肺、肝、腎等臟器。將上述組織固定于10%甲醛固定液中，石蠟包埋制片，HE染色，顯微鏡觀察。3、組織取材 將皮下瘤體、淋巴結(jié)、肺、肝、腎選取病變部位，切成23mm勺小于2cm*1cm大小的組織塊，10%中性甲醛固定。小塊組織一般固定數(shù)小時，較大標本需固定 2448小時。經(jīng)沖洗（用遞升濃度的酒精等）、透明（用二甲苯等）、浸蠟（用石蠟），然后用石蠟將組織包埋成蠟塊，再經(jīng)切片機切片和染色制成切片。 一般常規(guī)作蘇木精-伊紅

7、染色。4、切片染色 石蠟切片法、HE染色法。脫水程序及時間：組織固定，沖洗，然后:1)脫水：以下列順序進行：60%酒精30分鐘7 80%酒精12小時795%酒精24小時或過夜7 95%酒精24小時宀100%酒精24小時7 100%酒精24小時或過夜。2)透明：二甲苯I 3045分鐘；二甲苯n 3045分鐘。3)浸蠟。蠟碗I、n、m（各3045分鐘）;包埋。4)5)切片。6)烘烤。烘烤切片6070攝氏度，1小時。7)染色。HE切片染色程序與方法1）切片脫蠟水洗：將烘干的切片浸入二甲苯I、 n各510分鐘。無水酒精3-10分鐘（消除二甲苯）7 95%酉精13分鐘780%酒精13分鐘7 70%酉精1

8、3分鐘7 50%酉精13分鐘7自來水沖洗5分鐘以上（洗去切片上的酒精，切片透明）7蒸餾水清洗（防止污染蘇木精染液）。脫蠟是水化過程，目的是通過酒精的緩沖作用，易于水洗與染色。因為染劑是水，從無水酒精直接放入染液中，容易引起激烈的擴散作用，造成切片漂浮脫落或損傷組織。而經(jīng)各級濃度酒精緩沖后即可避免發(fā)生這種現(xiàn)象。2） HE染色 蘇木精-伊紅染色是先用蘇木精將組織切片適當?shù)倪^染，經(jīng)水洗后再用鹽酸酒精分化，弱堿性水溶液顯藍。使胞核呈明顯的藍色，胞質(zhì)及背景無色。再經(jīng)水洗后用伊紅染胞質(zhì)，染成深淺不同程度的粉紅色至紅色。蘇木染色（染核）515分鐘7自來水沖洗35分鐘7 0.5%鹽酸酒精溶液分化數(shù)秒鐘7自來水

9、洗15分鐘7弱堿性水溶液顯藍3060 秒7自來水沖洗510分鐘7蒸餾水洗12次7伊紅1分鐘7蒸餾水 洗12次。3）脫水、透明、封固：脫水、透明的目的是使存留在切片上的水分及漂浮的染色液全部除凈，經(jīng)透明劑的作用后，將脫水劑清除出來，使切片產(chǎn)生適宜的折光率。最后用蓋玻片及封固劑封固,便于觀察和長期保存。80%酉精3040秒7 95%酉精3060秒宀無水酒精I 15分鐘宀無水酒精n 15分鐘7二甲苯I 15分鐘7二甲苯n 15分鐘7中性樹膠封固。5、鏡下觀察。三、結(jié)果21天觀察10只小鼠，最終存活8只，其中形成腫塊7只，3只形成的腫塊較大。成瘤率70%淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率70%肉眼觀察：淋巴結(jié)較 正常增大，

10、皮下瘤體較大，與皮下組織粘附緊密，肝和腎臟可見腫瘤 結(jié)節(jié)，較大腫瘤2*1.5*1.3cm，灰白色，質(zhì)地較硬，從中間切開，發(fā) 現(xiàn)腫塊大部分壞死，中心部分出現(xiàn)腔，腔內(nèi)有腫瘤壞死物質(zhì)。鏡下觀 察，壞死組織粉染，輪廓尚存。殘存腫瘤組織細胞存在異型性：瘤細 胞大小和形態(tài)不一致，細胞核體積增大并呈現(xiàn)多形性，核漿比增大。核的大小、形狀和染色不一。核分裂象增多，核漿比失調(diào)，胞漿減少。四、討論將小鼠右腋皮下腋下作為腫瘤細胞的接種部位是其由于此處的 淋巴結(jié)相對較多，且有血循環(huán)豐富，利于腫瘤的轉(zhuǎn)移。人體內(nèi)對抗癌 細胞的功能主要由免疫系統(tǒng)承擔。免疫系統(tǒng)被腫瘤細胞阻塞，淋巴液 就會向相反的方向流動，導(dǎo)致不符合常規(guī)的轉(zhuǎn)移

11、現(xiàn)象。小鼠腹水型肝癌細胞瘤株屬于小鼠肝細胞癌。 由于615小鼠淋巴系統(tǒng)比較發(fā)達且有許多近交系，部分近交系有其特定的自發(fā)性腫瘤, 可利用其自發(fā)腫瘤與人體腫瘤的相似之處做為動物模型進行腫瘤發(fā) 生、發(fā)展和治療的研究。同時，胸腺嚴重缺陷的裸小鼠可接受人類各 種腫瘤細胞的植入，成為活的癌瘤細胞”試管"，是研究人類腫瘤生長 發(fā)育、轉(zhuǎn)移和治療的絕佳動物。在本實驗中觀察到的腫瘤細胞的異型性準要表現(xiàn)在以下幾個方 面：1 腫瘤細胞的多形性表現(xiàn)為瘤細胞大小不一，形態(tài)不規(guī)則，甚 至出現(xiàn)胞體特大的瘤巨細胞。少數(shù)分化差的腫瘤細胞較相應(yīng)組織的正 常細胞小，圓形，且大小較一致。2 核的多形性細胞核大小不一, 形態(tài)不

12、規(guī)則，甚至出現(xiàn)多核、巨核、畸形核瘤細胞。腫瘤細胞核明顯 增大，因而使核/漿比例增大，從正常的1:46增至1:1.52,甚至1:1。核染色質(zhì)呈粗大顆粒狀，分布不勻，?？拷四し植迹购四わ@得增 厚。核仁肥大，數(shù)目增多。核分裂像多見，并可出現(xiàn)病理性核分裂, 即多極性、不對稱性、頓挫型核分裂。惡性腫瘤細胞核多形性與染色 體呈多倍體或非整倍體有關(guān)。3 胞質(zhì)的改變惡性腫瘤細胞的胞質(zhì)一 般由于分化低而減少，但有時也可以增多。由于胞質(zhì)內(nèi)核蛋白體增多, 故多呈嗜堿性染色。 此次試驗便是通過建立小鼠腹水型肝癌淋巴道 高轉(zhuǎn)移細胞系HCF細胞模型，對腫瘤侵襲與淋巴道轉(zhuǎn)移的生物學 特性有所了解。通過模型的建立，染色制

13、片，鏡檢等一系列的過程建 立了科研的學術(shù)觀念，掌握了相關(guān)的專業(yè)知識。惡性腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的可能機制有 1、淋巴道轉(zhuǎn)移2、血道轉(zhuǎn)移3、種植性轉(zhuǎn)移。本實驗中重點研究淋巴道轉(zhuǎn)移，惡性腫瘤侵入淋巴管后,隨淋巴流首先到達局部淋巴結(jié)。 局部淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)以后， 可繼續(xù)轉(zhuǎn)移至下一站的其他淋巴結(jié)，最后，可經(jīng)胸導(dǎo)管入血再繼發(fā)血道轉(zhuǎn)移。值得注意的是，有的腫瘤可以逆行轉(zhuǎn)移或者越過相應(yīng)的引流淋巴結(jié)發(fā)生跳躍式轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞一般經(jīng)血液和淋巴道轉(zhuǎn)移，在實驗中經(jīng)過HE染色可以觀察到肝臟和腎臟有轉(zhuǎn)移瘤， 因而可以推斷小鼠腹水型肝癌細胞經(jīng)過了轉(zhuǎn)移，而且在淋巴結(jié)中也發(fā)現(xiàn)了腫瘤細胞， 也能說明小鼠腹水型肝癌細胞經(jīng)過淋巴道轉(zhuǎn)移。 本實驗結(jié)果

14、可以為預(yù)防惡性肝癌轉(zhuǎn)移提供較為清晰的預(yù)防思路。 參考文獻 1李甘地, 來茂德.病理學. 人民衛(wèi)生出版社 ,2001: 2612李連宏,唐建武 ,孫雷.醫(yī)學形態(tài)實驗學 . 人民衛(wèi)生出版社 ,2009 ：973孫成榮，唐建武，孫明忠，采用定量蛋白組學技術(shù)篩選小鼠肝癌巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白.生物化學與生物物理進展,2007,34(8):8568644 張宏穎, 劉春平, 唐建武, 許國旺, 等.姜黃素對小鼠腹水型肝癌高淋巴道轉(zhuǎn)移細胞株（HCa-F）生物學行為的影響.中國科學院上海冶金研究所; 材料物理與化學 （專業(yè)） 博士論文 2000 年度5Sobel MW.J Natl Cancer Inst,1990;82:2676Saigoh K, WangYL, Suh JG, et al. Intragenic deletion in thegene encoding ubiquitin carboxy-terminalhydrolase in gad mice、BurelillSA,et al.Br JJ. Nat Ge net. 1999, 23(1):47-51.6Ca ncer,1995;71:2787 李海燕,方肇勤,梁尚華.小鼠移植性肝癌(H22)模型的研究及在中醫(yī)藥抗腫瘤中的應(yīng)用.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志