兔C反應(yīng)蛋白酶聯(lián)免疫分析(CRP)ELISA

1、兔C反應(yīng)蛋白酶聯(lián)免疫分析（CRP）ELISA試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用產(chǎn)品編號(hào)：CSB-E06847Rb預(yù)期應(yīng)用ELISA法定量測(cè)定兔血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中CRP含量。概述C-反應(yīng)蛋白（CRP，C-Reactive Protein）是一種由肝臟生成出來的特殊蛋白，因?yàn)閷?duì)肺炎球菌的C 多糖體會(huì)有反應(yīng)，所以叫做C 反應(yīng)蛋白。C-活性蛋白（CRP）是炎癥和感染等癥狀的一個(gè)臨床標(biāo)記，但它也與受損的細(xì)胞結(jié)合，激發(fā)其補(bǔ)體（即參與免疫反應(yīng)的血清蛋白復(fù)合物）。實(shí)驗(yàn)原理本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中CRP水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中

2、依次加入CRP抗原、生物素化的抗兔CRP抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的CRP呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。 試劑盒組成 1. 酶聯(lián)板：一塊（96孔） 2. 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為5000 ng/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成2500 ng/mL，1250 ng/mL ，625 ng/mL，312.5 ng/mL，156 ng/mL，78

3、 ng/mL，39 ng/mL，其原液直接作為最高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。3. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。4. 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml/瓶。5. 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml/瓶。6. 檢測(cè)溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測(cè)稀釋液A1：100稀釋。稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測(cè)溶液A加99ul檢測(cè)稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。7. 檢測(cè)溶液B：1×120ul/瓶（1：

4、100）臨用前以檢測(cè)稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測(cè)溶液A。8. 底物溶液：1×10ml/瓶。 9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 標(biāo)本的采集及保存 1細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng)離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。2血清：標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。3血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?/p>

5、標(biāo)本放于-20保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注：標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。操作步驟各試劑在使用前平衡至室溫。1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)樣品100ul，注意不要有氣泡，輕輕混勻，酶標(biāo)板加上蓋，37反應(yīng)120分鐘。2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。3. 每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100ul，37,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。 4. 每孔加檢測(cè)溶液B工作液 100ul，37，60分鐘，洗板5次，甩干。5. 依序每孔加底物溶液90ul，37避光顯色30分鐘（此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3

6、-4孔梯度不明顯）。6. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時(shí)蘭色立轉(zhuǎn)黃色）。用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。 注：1 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。 2為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。 自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。特異性 本試劑盒可

7、同時(shí)檢測(cè)重組或天然的兔CRP，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。計(jì)算 以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。 注意事項(xiàng)1 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。2 一次加樣時(shí)間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。3 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。4 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以稀釋倍數(shù)。5在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。6底物請(qǐng)避光保存。檢測(cè)范圍：39 ng/mL -5000 ng/mL說明 1試劑盒保存：-20（較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)）；