蠶豆根尖微核試驗（B）——植物微核試驗（二）

1、蠶豆根尖微核試驗（b）植物微核試驗（二） 蠶豆（viciafaba)根尖細胞的染色體大，dna含量多，對誘變劑反應(yīng)敏感。蠶豆根尖微核技術(shù)是1982年由francesca和mate-hsiu建立的，在環(huán)境污染監(jiān)測和致突變劑檢測討論中得到廣泛應(yīng)用。 1儀器設(shè)備 顯微鏡、溫箱、恒溫水浴鍋、冰箱、記數(shù)器、解剖盤、鑷子、解剖針、載玻片、蓋玻片、試劑瓶、燒杯等。 2受試生物材料 推舉的蠶豆品種為松滋青皮豆，是篩選出的較為敏感的品種?？刹杉{挺直購買或引種栽培繁殖的辦法。 引種松滋青皮豆時，注重不要與其他蠶豆品種混種，不施用農(nóng)藥和化肥，以保持其較低的本底微核值。種子成熟曬干后，為保證其發(fā)芽率，應(yīng)貯于干燥器內(nèi)，

2、或用牛皮紙袋裝好后，放入4冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?假如只需對區(qū)域性水環(huán)境舉行監(jiān)測，也可用其他蠶豆品種。但應(yīng)注重其來源穩(wěn)定、牢靠。同時注重常常檢查其敏感性，以保證監(jiān)測數(shù)據(jù)的歷史延續(xù)性和可比性。 3.實驗程序 （1)試劑配置 5mol/lhcl。 卡諾氏液：無水乙醇（或95乙醇）3份加冰乙酸1份配成。固定根尖時隨用隨配。 席夫氏（schiff）試劑：稱0.5g堿性品紅（fuchsinbasic）加蒸餾水l00ml，置三角燒瓶中煮沸5min，并不斷攪拌使之溶解。冷卻到58時，過濾于深棕色試劑瓶中，待濾液冷至25時再加入10m11mol/lhcl和lg偏重亞硫酸鈉（na2s2o5）或偏重亞硫酸鉀(k2s2o

3、5）充分振蕩使其溶解。塞緊瓶口，用黑紙包好，置于暗處起碼24h，檢查染色液如透亮無色即可用法。此染色液在4冰箱內(nèi)可保存起碼6個月左右。如浮現(xiàn)沉淀，不行再用。 so2洗滌液： 儲藏液：10%na2s2o5（或10%k2s2o5）溶液；1mol/lhcl。 用法液：現(xiàn)用現(xiàn)配，取上述10%na2s2o5（或10%k2s2o5)溶液5ml，加lmol/lhcl5m1,再加蒸餾水l00ml配成。 (2）實驗步驟 1)蠶豆浸種催芽： 浸種：將當年或前一年的松滋青皮豆種子按需要量放入盛有自來水（或蒸餾水）的燒杯中，置于25的溫箱內(nèi)，浸泡26-30h，此期間起碼換水二次，換用的水最好事先置于25的溫箱內(nèi)預(yù)溫（

4、如室溫超過25，即可在室溫下舉行浸種催芽）。 催芽：待種子吸脹后，放置在解剖盤（或鋁盒）內(nèi)，用濕紗布靄蓋以保持濕度，在25的溫箱內(nèi)催芽12-30h。待種子初生根露出2-3mm時，再選取發(fā)芽良好的種子，放入鋪滿薄層濕脫脂棉的解剖盤（或鋁盒）內(nèi)，仍置入25的溫箱內(nèi)繼續(xù)催芽，注重保持濕度。再經(jīng)36-48h，種子大部分初生根長至2-3cm，根毛發(fā)育良好，即可用于監(jiān)測受試樣品的誘變效應(yīng)。 2)被監(jiān)測受試樣品液處理根尖：每一處理選取6-8粒初生根生長良好、根長全都的種子，放入盛有被測液的培養(yǎng)皿中，讓被測液浸泡根尖即可。用自來水（或蒸餾水）處理作對比，辦法相同。處理時光4-6h，視實驗要求和被測液的濃度等狀

5、況而定。 3)根尖細胞復(fù)原培養(yǎng)：將處理后的種子，用自來水（或蒸餾水）浸洗三次，每次2-3min。洗凈后的種子再放入新鋪好濕脫脂棉的解剖盤（或鋁盒）內(nèi)，按前述培養(yǎng)條件使根尖細胞復(fù)原固定22.24h。 固定根尖細胞：將復(fù)原后的種子，從根尖頂端切下lcm長的幼根放入青霉素空瓶中，加卡諾氏固定液24h。固定后的幼根如不準時制片，可換入70乙醇中，放置4冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?5)孚爾根（feulgen）染色：固定好的幼根，在青霉素瓶中用蒸餾水浸洗二次，每次5min。吸凈蒸餾水，再加入5mol/lhcl將幼根沉沒，連瓶放入28水浴鍋中水解幼根25min左右（視根軟化的程度可適當增減時光），至幼根被軟化即可。用

6、蒸餾水浸洗幼根二次，每次5min。在暗室或遮光的條件下加席夫（schiff）試劑，每瓶用量以沉沒幼根后液面高出2mm為宜。除去染液，用so2洗滌液浸洗幼根二次，每次5min。用蒸餾水浸洗5min。將幼根放入新?lián)Q的蒸餾水中，放入4冰箱內(nèi)保存，供隨時制片用。 6）制片：將幼根放在擦凈的載玻片上，用解剖針截下1mm左右的根尖。滴上少許45%的乙酸溶液，用解剖針將根尖搗碎。加蓋一清潔的蓋玻片，注重不要有氣泡。再在蓋玻片上加一小塊濾紙，輕小扣打壓片。 7）鏡檢及微核識別標準：將制片先置于顯微鏡低倍鏡下，找到分生組織區(qū)細胞簇擁勻稱、膨大、分裂項較多的部位，再轉(zhuǎn)到高倍鏡（物鏡40×）下舉行觀看。

7、微核識別的標準： 大小為主核的1/3以下，且與主核分別。 著色與主核相當或稍淺。 形態(tài)可為圓形、橢圓形、不規(guī)章形。 每一處理觀看三個根尖，每個根尖計數(shù)1000個細胞中的微核數(shù)。 4質(zhì)量保證與質(zhì)量控制 對嚴峻污染的水環(huán)境，監(jiān)測時可能造成根尖死亡，應(yīng)稀釋后再作測試。 在沒有空調(diào)等恒溫設(shè)備的條件下，如室溫超過35。微核率本底可能有上升現(xiàn)象，但可采納污染指數(shù)法評價，不會影響監(jiān)測結(jié)果。 5數(shù)據(jù)與報告 （1)數(shù)據(jù)處理 將微核觀看記載表上所得數(shù)據(jù)，按如下步驟舉行統(tǒng)計學(xué)處理。 按以下公式計算各測試樣品（包括對比組）的微核千分率（mcn%o): mcn=某測試樣點（或?qū)Ρ龋┯^看到的mcn數(shù)/某測試樣點（或?qū)Ρ龋?/p>

8、觀看的細胞數(shù)×1000 假如受試樣品不多，可挺直用各樣品mcn率平均值與對比比較（(t檢驗），從差異的顯著性推斷水質(zhì)污染與否。 假如受試樣品較多，可先用方差分析（f檢驗）看各采樣點（或各樣品）所浮現(xiàn)的mcn率平均值和對比的差異顯著性。如差異顯著，還可舉行各采樣點微核差異顯著性的多重比較，看受試樣品mcn率平均值差異的分組狀況，以歸納劃分這些不同采樣點不同級別的污染程度。 如采納已篩選出的、又特地隔離栽培、無污染的松滋青皮豆作供試材料，并按規(guī)范試驗條件（其對比本底mcn為l0以下），受試樣品污染程度的劃分，可不用上述兩種統(tǒng)計處理辦法，挺直采納（2)的評價標準舉行評價。 (2）結(jié)果評價 凡數(shù)值在上、下限值時，定為上一級污染。 "mcn%”判別：當符合（1)時，可利用mcn按如下標準挺直評價： mcn%在10以下為基本沒有污染；10-18區(qū)間為輕污染；18-30區(qū)間為中污染；30以上為重污染。 “污染指數(shù)”判別：此辦法可避開因試驗條件等因素帶來的mcn%本底的波動。 污染指數(shù)（pi)樣品實測mcn平均值/標準水（對比組）mcn平均值 污染指數(shù)在0-1.5區(qū)間為基本沒有污染；1.5-2區(qū)間為輕污染；2-3.5區(qū)間為中污染；3.5以上為重污染。 (3）結(jié)果報告 受試物：名稱、來源、采樣時光、地點等。 濃度：受