轉(zhuǎn)運(yùn)體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

1、轉(zhuǎn)運(yùn)體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn) 為了考察單一轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)藥物跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，近年來，討論者利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，使mdck或llc-pk細(xì)胞高表達(dá)某個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體，建立該轉(zhuǎn)運(yùn)體的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型，從而更直觀的觀看其對(duì)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，探索轉(zhuǎn)運(yùn)體與藥物的互相作用關(guān)系。應(yīng)用轉(zhuǎn)染細(xì)胞藥物轉(zhuǎn)運(yùn)模型，能夠削減其他轉(zhuǎn)運(yùn)體的干擾，便利快捷的得到特定轉(zhuǎn)運(yùn)體與藥物的關(guān)系，從而預(yù)測(cè)藥物的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為，極大地推進(jìn)了藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的討論和新藥研發(fā)的進(jìn)程。例如hmdri-mdck或hmdri-llc-pk細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型，能夠很好預(yù)測(cè)藥物在透過血一腦脊液屏障的能力。目前，幾乎全部已克隆的轉(zhuǎn)運(yùn)體都有細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型見諸報(bào)道，廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)運(yùn)體討論領(lǐng)域和藥物

2、篩選開發(fā)過程中。 雙轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型的建立，是藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體討論領(lǐng)域的又一重大突破。雙轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型利用模型細(xì)胞的極性分化特性，將兩種轉(zhuǎn)運(yùn)體基因轉(zhuǎn)染表達(dá)于同一細(xì)胞的不同生物膜上，使藥物從基底側(cè)膜攝取進(jìn)入細(xì)胞，再經(jīng)頂側(cè)膜外排轉(zhuǎn)運(yùn)體泵出，從而考察藥物跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的囫圇過程中轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能和作用。這一模型不僅完善的解決了單轉(zhuǎn)染細(xì)胞惟獨(dú)“進(jìn)”或惟獨(dú)“出”的缺陷，還在形態(tài)學(xué)和功能上越發(fā)臨近體內(nèi)藥物處置過程，是考察肝細(xì)胞和腎細(xì)胞處置藥物的高效體外模型（圖11-8)。近來，oatps/oats/octs等攝取型轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)于基底側(cè)膜（血管側(cè)膜）、mdr1/mrp2等外排型轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)于頂側(cè)膜（膽管側(cè)膜或腎小管刷狀緣膜

3、）的雙轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型越來越多的應(yīng)用于藥物的膽汁排泄和尿液排泄機(jī)制討論當(dāng)中。 下面，分離以單轉(zhuǎn)染的mdrl-mdck細(xì)胞和雙轉(zhuǎn)染的oatpib1/mrp2-mdck細(xì)胞為例（圖11-9)，介紹轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型在藥物與轉(zhuǎn)運(yùn)體關(guān)系討論中的應(yīng)用。 【材料】 1狀態(tài)良好的mock-mdck細(xì)胞（空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的mdck 細(xì)胞），mdr1-mdck 細(xì)胞，oatpl b1-mdck 細(xì)胞，mrp2-mdck 細(xì)胞，oatpibi/mrp2-mdck 細(xì)胞。 2試劑 胰蛋白酶、小牛血清、培養(yǎng)基（dmem培養(yǎng)粉）、雙抗。檢測(cè)試劑盒、或熒光黃、d-hanks液（每1000ml含nacl 8.00g, kcl 0.

4、40g，nah2p04·h2o 0.06g, nahc03 0.35g，0.02g)、hanks液（在d-hanks液加mgs04·7h20 0.20g, cacl2（無水）0.14g、1.00g) ,75。 3儀器 凈化工作臺(tái)、c02孵箱、倒置顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、電阻儀、酶標(biāo)儀,transwe小室、hplc/ms/ms（或核素標(biāo)志檢測(cè)）。 【辦法】 1轉(zhuǎn)運(yùn)模型的構(gòu)建復(fù)蘇mdck 系列細(xì)胞，培養(yǎng)辦法同caco-2細(xì)胞培養(yǎng)；顯微鏡觀看mdck 系列細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，形態(tài)規(guī)章，分化完好，邊界清楚；同時(shí)，各種細(xì)胞生長(zhǎng)速度全都，即可接種鋪板。 將狀態(tài)良好的細(xì)胞消化，吹打勻稱，調(diào)整密

5、度104105/ml，吸取0.4ml細(xì)胞懸液接種于transwe小室，置于24孔板中，外孔加0.6ml培養(yǎng)液，內(nèi)外孔液面大致等高。隔天換液。細(xì)胞模型培養(yǎng)35天，檢測(cè)細(xì)胞單層完整性，即可用于轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。 2細(xì)胞單層完整性檢測(cè)常采納檢測(cè)電阻和被動(dòng)蔓延標(biāo)記物通透率的辦法驗(yàn)證單層細(xì)胞的完整性，辦法同caco-2細(xì)胞單層完整性檢測(cè)。mdck 系列細(xì)胞培養(yǎng)35天，teer值可達(dá)到100800·cm2,酚磺酞等標(biāo)記物的漏出量應(yīng)小于5%，滿足pepp10-7cm/s。 3細(xì)胞單層功能性檢測(cè)常用轉(zhuǎn)運(yùn)體典型底物的轉(zhuǎn)運(yùn)考察轉(zhuǎn)染細(xì)胞單層功能分化狀況，單轉(zhuǎn)染的mdrl-mdck細(xì)胞采納rhodamine 123

6、或calcein-am的轉(zhuǎn)運(yùn)，雙轉(zhuǎn)染的oatpib1/mrp2-mdck 細(xì)胞采納e217g(oatp1b1和mrp2的共同底物）的轉(zhuǎn)運(yùn)來考察。 也可采納rt-pcr和western-blot考察目的基因的表達(dá)狀況，以此驗(yàn)證轉(zhuǎn)染細(xì)胞的構(gòu)建狀況。 4雙向轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)首先棄去transwe小室內(nèi)外培養(yǎng)液，用37 hanks液輕柔地清洗細(xì)胞表面3次以除去表面的雜質(zhì)，然后加入37 hanks（液內(nèi)孔0.4 ml，外孔0.6m1)置于37孵箱中孵育30分鐘。 吸去緩沖溶液，在ap側(cè)（內(nèi)孔）加入0.4m1含有受試藥物的hanks液，作為供應(yīng)液，在bl側(cè)（外孔）加入0.6m1空白的hanks液作為接收液。此為汲

7、取方向，a-b。 同時(shí)，另選其他小室，在bl(外孔）側(cè)加入0.6m1含有受試藥物的hanks液，作為供應(yīng)液，在ap側(cè)（內(nèi)孔）加入0.4m1空白的hanks液作為接收液。此為分泌方向，b-a。 將載有transwe小室的24孔板于恒溫?fù)u床（37, 50r/min）中溫孵，設(shè)定時(shí)光（0.5小時(shí)，1小時(shí)，2小時(shí)，3小時(shí)）從接受池取出50ul的接受液待測(cè)，然后補(bǔ)加相應(yīng)體積的空白37 hanks液。 轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)結(jié)束后，夾出transwe小室，用冰冷d-hanks液徹底沖洗，置入新的24孔板中，向小室內(nèi)加入200ul裂解液，恒溫?fù)u床（37,50r/min）中裂解2小時(shí)。裂解液測(cè)定藥物濃度和蛋白含量。 樣品加

8、等體積乙腈沉淀蛋白，渦旋，離心，吸取上清液吹干，流淌相復(fù)溶，渦旋，離心，吸取上清液進(jìn)樣，質(zhì)譜檢測(cè)。蛋白含量用bca試劑盒測(cè)定。 結(jié)果與分析 1單轉(zhuǎn)染mdrl-mdck 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型結(jié)果分析應(yīng)用mdrl-mdck 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型舉行藥物的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)，須設(shè)置mock-mdck 細(xì)胞作為對(duì)比，同時(shí)考察藥物在兩種細(xì)胞單層的papp。由藥物的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)papp(a-b）和papp(b-a)，計(jì)算得到外流比（er,efflux ratio)=papp(b-a)/papp(a-b)。假如藥物應(yīng)用mdri-mdck細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型得到的er大于1.5，則提醒mdri可能參加了該藥物的外排轉(zhuǎn)運(yùn)。同時(shí)，為了排解野生型m

9、dck細(xì)胞對(duì)藥物的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)運(yùn)，還應(yīng)考察mdrl-mdck 細(xì)胞和mock-mdck 細(xì)胞的er之比，稱為凈外流比(net efflux ratio)，該值也可反映轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的構(gòu)建狀況（表11-1）。 2雙轉(zhuǎn)染oatpibi/mrp2-mdck 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型結(jié)果分析應(yīng)用oatpi b1/mrp2-mdck 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型舉行藥物的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)，須設(shè)置mock-mdck , oatp1bl-mdck 細(xì)胞，mrp2-mdck 細(xì)胞作為對(duì)比，同時(shí)考察藥物在四種細(xì)胞單層的papp。例如該模型的驗(yàn)證底物e217g在四種細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)狀況11-10所示。 e217g是oatpib1和mrp2的共同底物，單轉(zhuǎn)染

10、oatplbl或mrp2的mdck 細(xì)胞和mock-mdck 細(xì)胞相比，對(duì)e217g的轉(zhuǎn)運(yùn)沒有顯然的影響。假如考察轉(zhuǎn)運(yùn)后e217g在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，可發(fā)覺單轉(zhuǎn)染oatpibi-mdck 細(xì)胞內(nèi)e217g蓄積顯著多于mock-mdck細(xì)胞。應(yīng)用雙轉(zhuǎn)染oatpibi/mrp2-mdck 細(xì)胞，e217g經(jīng)oatplb1攝入，再經(jīng)mrp2泵出，外排率顯著增大。 【注重事項(xiàng)】 1鋪板轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型需要用法兩種或多種細(xì)胞，在鋪板前須保證各種細(xì)胞狀態(tài)相近，生長(zhǎng)速度全都，這樣才干保持相同的形成細(xì)胞單層時(shí)光，用于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。同時(shí)，要防止細(xì)胞之間混淆污染，導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)功能和屬性的走失。 2確保的細(xì)胞單層完整性mdck細(xì)胞單層完整性也可通過測(cè)定單細(xì)胞層電阻(teer)、檢測(cè)標(biāo)記物被動(dòng)蔓延的跨膜通量、檢測(cè)緩沖液中（ldh）含量變幻等辦法考察。