研究生實(shí)驗(yàn)PCR檢測apoB基因多態(tài)性ppt課件VIP

1、31.2 1.2 不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度（，（，W/ V ) DNA分子的有效分離范圍（分子的有效分離范圍（kb)0.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-22 2 實(shí)驗(yàn)材料及試劑實(shí)驗(yàn)材料及試劑瓊脂糖瓊脂糖 電泳緩沖液：電泳緩沖液：1 1 TAETAE（Tris acetate-EDTA buffer Tris acetate-EDTA buffer ） 6 6 加樣緩沖液加樣緩沖液 （溴酚藍(lán)（溴酚藍(lán)/ /二甲苯青二甲苯青/ /甘油）甘油） EBEB染色液（溴化乙錠，染色液（溴化乙錠，ethi

2、dium bromideethidium bromide） 瓊脂糖凝膠板的制備瓊脂糖凝膠板的制備（封板、制備（封板、制備1.5%的預(yù)染或未染的凝膠、倒膠、插梳、凝固后拔梳）的預(yù)染或未染的凝膠、倒膠、插梳、凝固后拔梳）將膠置于電泳槽將膠置于電泳槽 （注意上樣孔位于電泳槽負(fù)極一側(cè)）（注意上樣孔位于電泳槽負(fù)極一側(cè)）倒緩沖液倒緩沖液（沒過膠約（沒過膠約1mm） 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)步驟步驟上樣上樣紫外燈下檢測紫外燈下檢測（apoB基因基因PCR產(chǎn)物：雙條帶或單條帶，產(chǎn)物：雙條帶或單條帶，700bp左右）左右）取取apoB基因基因PCR產(chǎn)物產(chǎn)物20 l上樣上樣（按學(xué)號加樣：（按學(xué)號加樣：DNA marker，樣品樣

3、品1, 樣品樣品2, 樣品樣品3, 樣品樣品4 ）apoB基因基因PCR產(chǎn)物電泳產(chǎn)物電泳（1.5%膠，膠，100V, 1小時(shí)）小時(shí)）1. 電泳前準(zhǔn)備2. 制膠3. 上樣電泳4. 染色成像Kary MullislP C R 技 術(shù) 最 早 由 美 國技 術(shù) 最 早 由 美 國 Cetus公司人類遺傳研究室公司人類遺傳研究室Kary Mullis及同事于及同事于1985年發(fā)現(xiàn)并研制成功的；年發(fā)現(xiàn)并研制成功的；lKary Mullis因發(fā)明了因發(fā)明了“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”而獲而獲得得1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 PCR由上述高溫變性、低溫退火及適當(dāng)溫度延由上述高溫變性、低溫

4、退火及適當(dāng)溫度延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行后使目伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行后使目的的DNA得以迅速擴(kuò)增。得以迅速擴(kuò)增。5335（二）（二）PCR反應(yīng)體系的組成及功能反應(yīng)體系的組成及功能 PCR的完成是在一個(gè)的完成是在一個(gè)0.5ml的的EP管中完成，一個(gè)管中完成，一個(gè)完整的完整的PCR反應(yīng)體系應(yīng)包括以下成分：反應(yīng)體系應(yīng)包括以下成分： 1. 引物引物 2.模板模板DNA 3. Taq DNA聚合酶聚合酶 4. dNTP 5. 10PCR反應(yīng)反應(yīng)buffer（含鎂離子）（含鎂離子） 設(shè)計(jì)原則：設(shè)計(jì)原則：（1）引物長度：）引物長度： 15-30bp，常用為，常用為20bp左右。左右。（

5、2）引物擴(kuò)增跨度：）引物擴(kuò)增跨度： 以以200-500bp為宜，特定條件下為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至可擴(kuò)增長至10kb的片段。的片段。（3）引物堿基：）引物堿基：G+C含量以含量以40-60%為宜，為宜，G+C太少太少擴(kuò)增效果不佳，擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。苷酸的成串排列。 （4） 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是是3端的端的 互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條互補(bǔ)，否則會(huì)形

6、成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。帶。l Primer 本身不要出現(xiàn)內(nèi)部互補(bǔ)序列本身不要出現(xiàn)內(nèi)部互補(bǔ)序列, 形成內(nèi)部形成內(nèi)部loop環(huán)二環(huán)二級結(jié)構(gòu)級結(jié)構(gòu), 如：如：GGGTCGATTCCTACCCATGCl 注意減少注意減少Primer間互補(bǔ)序列間互補(bǔ)序列,導(dǎo)致導(dǎo)致2個(gè)個(gè)Primer形成形成dimer , 一般不要超過一般不要超過 3個(gè)互補(bǔ)個(gè)互補(bǔ)bp 如：如：CCCATGC ATGGAGTC : : : : : : : : GGGTCTA TCAGTAAGC （5） 引物引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不

7、配對而導(dǎo)致要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。失敗。 （6）引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。同源性。 修飾：修飾： 如：如：32P、生物素、熒光素，不影響其效果、生物素、熒光素，不影響其效果 突變：突變： AGCTCCATGACCCAG 5CGCTCCATGACCCAG 3 注意：絕不可以在注意：絕不可以在3端進(jìn)行上述改造端進(jìn)行上述改造 DNA聚合酶是聚合酶是53聚合，若聚合，若3端改造端改造不能互補(bǔ)不能互補(bǔ)不能延伸不能延伸 （7） Primer 5未端可修飾、突變未端可修飾、突變: （8） prim

8、er 5端增加堿基端增加堿基: 引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對酶切分析或分子克隆很有好處。酶切分析或分子克隆很有好處。 內(nèi)切酶識別點(diǎn)：內(nèi)切酶識別點(diǎn)： （G）GAATTC GCTCCATGACCCAG 保護(hù)保護(hù)bp 對對PCR產(chǎn)物產(chǎn)物cloning有很大好處有很大好處 ATG起始密碼起始密碼 TAA、TAG、TGA終止密碼終止密碼如：可溶性受體的表達(dá)，無膜內(nèi)區(qū)、穿膜區(qū)，只有膜外區(qū)。如：可溶性受體的表達(dá)，無膜內(nèi)區(qū)、穿膜區(qū)，只有膜外區(qū)。 2. Taq DNA聚合酶聚合酶水生棲熱菌水生棲熱

9、菌(thermus aquaticus,Taq)的的DNA聚合酶，其特點(diǎn)有：聚合酶，其特點(diǎn)有： 53DNA聚合酶活性；聚合酶活性； 無無35外切酶活性，因此無校正功能；外切酶活性，因此無校正功能； 有良好的熱穩(wěn)定性，有良好的熱穩(wěn)定性， 最適聚合酶最適聚合酶 溫度溫度72，選擇，選擇72延伸；延伸； 半衰期：半衰期： 92.5 130min 95 40min 97.5 56min 變性溫度變性溫度95，使其在整個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中保持足夠活性，使其在整個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中保持足夠活性； 其活性對其活性對Mg2+濃度非常敏感；濃度非常敏感； 終濃度一般為：終濃度一般為：2.5U/100ul； 3. 模板模板DNA

10、 （1）模板用量）模板用量 Plasmid:1ng, Chromosome:300-500 ng, 一般認(rèn)為一般認(rèn)為102104拷貝模板就可以滿足要求?？截惸０寰涂梢詽M足要求。 （2）可選可選DNA 質(zhì)粒、質(zhì)粒、 噬菌體、染色體噬菌體、染色體DNA 注意：注意： 防止交叉污染防止交叉污染5. 10PCR反應(yīng)反應(yīng)buffer (1) 250500mmol/L KCl； (2) 100500mmol/LTris-HAC (pH8.4)； (3) 1520mmol/L MgCl2（對（對Taq酶的活性影響很大，酶的活性影響很大，一般濃度為一般濃度為1.52.0mmol/L，實(shí)際應(yīng)用時(shí)根據(jù)反，實(shí)際應(yīng)用

11、時(shí)根據(jù)反應(yīng)體系的情況進(jìn)行調(diào)整）；應(yīng)體系的情況進(jìn)行調(diào)整）； (4) 0.1%明膠或牛血清白蛋白明膠或牛血清白蛋白Mg2+ (1)TaqDNA聚合酶作用時(shí)需要聚合酶作用時(shí)需要Mg2+ (2)不同的酶需不同不同的酶需不同Mg2+ (3) Taq：Mg2+ 對反應(yīng)影響很大，對反應(yīng)影響很大，1-3 mM終濃度終濃度外界影響：外界影響： (1) EDTA鰲合鰲合Mg2+ 選較低濃度選較低濃度TE(10mM Tris,1mM EDTA)； (2) DNA模板、引物和模板、引物和dNTP 的磷酸基團(tuán)均可與的磷酸基團(tuán)均可與Mg2+ 結(jié)合，結(jié)合， 降低降低Mg2+有效濃度有效濃度 如果擴(kuò)增產(chǎn)物或效率不理想，要注意

12、調(diào)整如果擴(kuò)增產(chǎn)物或效率不理想，要注意調(diào)整Mg2+濃度濃度（三）（三） PCR反應(yīng)條件反應(yīng)條件1.PCR循環(huán)的溫度和時(shí)間循環(huán)的溫度和時(shí)間（變性、退火、延伸）（變性、退火、延伸）2. PCR循環(huán)的次數(shù)和平臺(tái)效應(yīng)循環(huán)的次數(shù)和平臺(tái)效應(yīng) （1）變性溫度變性溫度：94-95 Templete：GC比例高、長度很長，則變性時(shí)間比例高、長度很長，則變性時(shí)間 （2）退火退火：溫度越高，擴(kuò)增特異性越好溫度越高，擴(kuò)增特異性越好 取決于引物取決于引物Tm值：值：Tm值值=4(G+C) 2(A+T) ； 復(fù)性溫度復(fù)性溫度=Tm值值-(510) ，一般在，一般在4555 ； Tm退火退火T，Tm退火退火T ； 若若Tm較

13、高，可使退火和延伸在同一溫度較高，可使退火和延伸在同一溫度（3) 延伸延伸：72 1min/kb（10kb內(nèi)）內(nèi)） 一般：一般：4060sec 溫度和時(shí)間溫度和時(shí)間Plateau phase in PCR（四）（四） PCR 的特點(diǎn)的特點(diǎn) 操作簡單操作簡單 省時(shí)：省時(shí)：1-2 hr 靈敏度高：靈敏度高：pg 特異性強(qiáng)特異性強(qiáng) 對原始材料質(zhì)量要求低對原始材料質(zhì)量要求低 有一定程度的單核苷酸錯(cuò)誤摻入有一定程度的單核苷酸錯(cuò)誤摻入 適用于克隆序列清楚的基因適用于克隆序列清楚的基因2 2 基因多態(tài)性類型的檢測基因多態(tài)性類型的檢測 （1）限制性片段長度多態(tài)性）限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記標(biāo)記：由于

14、限制性內(nèi)切酶酶切位：由于限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)或位點(diǎn)間點(diǎn)或位點(diǎn)間DNA區(qū)段發(fā)生突變引起的。區(qū)段發(fā)生突變引起的。（2）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)標(biāo)記：標(biāo)記：RAPD是通過短的隨機(jī)引物擴(kuò)增是通過短的隨機(jī)引物擴(kuò)增個(gè)體基個(gè)體基 因組因組DNA體現(xiàn)多態(tài)性。體現(xiàn)多態(tài)性。 （3）擴(kuò)增片段長度）擴(kuò)增片段長度(AFLP)多態(tài)性標(biāo)記多態(tài)性標(biāo)記：AFLP是將是將PCR技術(shù)與技術(shù)與RFLP結(jié)合的一種方法，通過對基因組結(jié)合的一種方法，通過對基因組DNA酶切片段的選擇性擴(kuò)增來檢測酶切片段的選擇性擴(kuò)增來檢測DNA酶切片段長度的多態(tài)性。酶切片段長度的多態(tài)性。 （4）微衛(wèi)星多態(tài)性標(biāo)記）微衛(wèi)星多態(tài)性標(biāo)記(SSRP)：基于基于PCR技術(shù)的技術(shù)的DNA標(biāo)記，多態(tài)性標(biāo)記，多態(tài)性是由同一座位上的串聯(lián)單元數(shù)量的不同而產(chǎn)生的。是由同一座位上的串聯(lián)單元數(shù)量的不同而產(chǎn)生的。 （5）單鏈構(gòu)象多態(tài)性標(biāo)記）單鏈構(gòu)象多態(tài)性標(biāo)記(SSCP) （6）單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記）單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SNP)：將被測：將被測DNA片段與高密度片段與高密度DNA探針探針(中部單核苷酸中部單核苷酸 替代探針替代探針)微陣列雜交，一次性快速顯示被測序列的微陣列雜交，一次性快速顯示被測序列的單核苷酸多態(tài)性，并通過計(jì)算機(jī)分析單核苷酸多態(tài)性，并通過計(jì)算機(jī)分析 雜交類型，最終顯示雜交類型，最終顯示SNP結(jié)結(jié)果果