鹽酸氨溴索對慢性哮喘大鼠氣道炎癥及杯狀細胞增生的影響探析

1、鹽酸氨溴索對慢性哮喘大鼠氣道炎癥及杯狀細胞增生的影響探析    【摘要】目的:觀察藥物鹽酸氨溴索對慢性哮喘大鼠氣道炎癥及杯狀細胞增生(GCH)的影響,探討在哮喘防治中的作用.方法:用卵白蛋白致敏、激發(fā)建立大鼠哮喘模型,54只Wistar大鼠隨機分為3組:正常對照組、哮喘組、鹽酸氨溴索治療組(簡稱治療組),每組18只.激發(fā)哮喘后測定氣道內壓的變化;支氣管肺泡灌洗液(BALF)內細胞計數、分類計數,HE染色及AB-PAS染色觀察肺組織病理改變及杯狀細胞增生狀況.結果:治療組氣道內壓增加的百分數明顯低于哮喘組(P<0.01);治療組BALF細胞總數及炎癥

2、細胞數明顯低于哮喘組(P道,未見粘液潴留.結論:鹽酸氨溴索可抑制哮喘大鼠氣道GCH,改善哮喘氣道炎癥,對哮喘的防治有一定作用.【關鍵詞】哮喘 氨溴索 杯狀細胞Effect of ambroxol on airway inflam-mation and goblet cell hyperplasia ofchronic asthmatic rat 【Abstract】AIM:To evaluate the protective effect of ambroxolin asthma, we observed the effect of ambroxol on airway in-fla

3、mmation and airway goblet cell hyperplasia (GCH) of chronicasthmatic rat.METHODS:Rat asthma models were estab-lished with the ovalbumin sensitization and provocation method.Fifty-four Wistar rats were divided into three groups randomly:Normal control group (n=18);blank asthma group (n=18);ambroxol g

4、roup (n=18). Sensitized rats were treatedwith ambroxol daily (10mg·kg-1·d-1) during the period of al-lergen and provocation. The change in intratra-cheal pressure of sensitized rats was recorded. The total anddifferential white blood cell counting of bronchial alveolarlavage fluid (BALF) w

5、as calculated. Lung tissue sections werestained with hematoxylin and eosin for general morphology andAlician Blue-Periodic Acid Schiff (AB-PAS)for identification ofgoblet cells. The pathologic changes were observed under anoptical microscope.RESULTS:Percentage of increased intra-tracheal pressure in

6、 ambroxol group was significantly lower thanthat in the blank asthma group (P<0.01). The bronchoconstriction and inflammatory cells infiltrationsurrounding bronchi in the asthma group were observed. Amarked and extensive airway GCH and mucus retention in air-way lumen in the blank asthma group we

7、re also observed. Theairway inflammation and GCH were significantly alleviated andno mucus retention in the airway lumen was observed in Am-broxol group. Mildly GCH was restricted in the larger airways.CONCLUSION:Ambroxol can alleviate the airway inflammationand suppress GCH in chronic asthmatic rat

8、s. Ambroxol is valu-able in the prophylaxis and treatment of asthma.【Keywords】asthma; ambroxol; goblet cells 0引言 氣道上皮杯狀細胞增生(goblet cell hyperplasia,GCH)是哮喘的病理特征之一,是哮喘時氣道上皮最明確的改變. GCH可引起氣道上皮增厚,糖蛋白分泌增加,導致氣道管腔狹窄,氣道阻力增加.鹽酸氨溴索(Ambroxol,商品名mucosulvan),是一種常用的祛痰劑,近年來其對呼吸系統(tǒng)的保護作用倍受關注,它可以抑制粘液腺和杯狀細胞中酸

9、性糖蛋白合成.我們應用鹽酸氨溴索對慢性哮喘大鼠進行干預,觀察其長期作用對哮喘大鼠GCH及氣道炎癥的影響.1材料和        方法 1.1材料雄性Wistar大鼠54只,體質量(250±50) g,由第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供.卵白蛋白為美國Sigma公司產品.鹽酸氨溴索片由德國勃林格英格翰公司提供.阿爾辛藍(Alcian blue 8GX)為美國Amersco公司產品. EJD-IV型生物信號處理系統(tǒng)系第二軍醫(yī)大學生理教研室研制.定容型動物呼吸機DH-1408型為浙江大學醫(yī)學院醫(yī)學儀器試驗

10、廠生產.1.2方法1.2.1動物分組及模型制備用卵白蛋白致敏、激發(fā)建立大鼠哮喘模型.參照文獻1稍加改變復制哮喘大鼠模型:哮喘組,予免疫原液1 mL(含卵蛋白100 mg、氫氧化鋁100 mg)胸前皮下注射致敏,同時ip氣管炎疫苗(含5×1012個滅活菌),第15日起予1g·L-1卵蛋白超聲霧化吸入,每日20 min,連續(xù)7 d.鹽酸氨溴索治療組致敏前1 wk即開始ig給予鹽酸氨溴索片10 mg·kg-1·d-1,2次·d-1ig喂食,與哮喘組同時致敏、激發(fā),處理亦相同,但實驗中一直服用鹽酸氨溴索,共連續(xù)服用4 wk.正常對照組予生理鹽水胸前sc

11、及ip,第15日起予生理鹽水超聲霧化吸入,每日20 min,連續(xù)7 d.1.2.2氣道內壓測定末次激發(fā)前各組大鼠隨機取5只檢測激發(fā)前后氣道內壓的變化,戊巴比妥鈉ip麻醉,氣管插管,Y形管分別連接定容呼吸機、壓力傳感器及生物信號處理系統(tǒng),先記錄未激發(fā)時氣道內壓,待壓力平穩(wěn)后各組分別予10 g·L-1生理鹽水及卵蛋白氧氣驅動霧化激發(fā)20 min,激發(fā)后持續(xù)記錄氣道內壓60 min,觀察氣道內壓變化,計算記錄過程中氣道內壓的最大增幅作為氣道內壓變化的指標.計算公式:氣道內壓增加的百分數=(激發(fā)后氣道內壓-激發(fā)前氣道內壓)/激發(fā)前氣道內壓×100%.1.2.3病理學檢查每組隨機取5

12、只大鼠于末次激發(fā)后行病理檢查,每葉肺取樣進行脫水,石蠟包埋連續(xù)切片,片厚5m,行HE染色及阿爾辛藍-糖原染色(AB-PAS染色). AB-PAS染色:切片入10 g·L-1阿爾辛藍(pH 2.5)染色30 min, 10 mL·L-1過碘酸氧化10 min,再入Schiffs液暗處加蓋30 min左右,作蘇木素核襯染,中性粘液呈紅色,酸性粘液物質呈藍色,混合性粘液呈紫紅色,氣道上皮細胞胞質被染成藍色或紫紅色的為杯狀細胞.光鏡下觀察,按Ceng2的方法每只大鼠觀察5張不同部位的切片,每張切片觀察12個高倍視野的杯狀細胞總數,其中葉支氣管、小支氣管、細支氣管或終末細支氣管各4個

13、視野,計算其平均值.1.2.4支氣管肺泡灌洗液計數及分類其余大鼠末次激發(fā)后行支氣管肺泡灌洗,收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)并記錄回收量.用血球計數板行BALF細胞計數并計算細胞總數,將BALF 4離心(2500 r·min-1, 8 min),取沉渣適量涂片,采用瑞氏染色法進行染色,鏡檢300個細胞按照形態(tài)學標準進行細胞分類計數.統(tǒng)計學處理:應用統(tǒng)計軟件SPSS進行數據分析,數據用x±s表示,采用完全隨機設計資料的方差分析和LSD-t檢驗檢測樣本均數差異的顯著性.2結果 2.1氣道內壓的變化各組大鼠激發(fā)前氣道內壓無顯著差異(P>0.05).正常對照組超聲霧

14、化生理鹽水后氣道內壓平均最大增幅為(18.4±4.7)%, 10min左右恢復至正常;哮喘組大鼠卵蛋白激發(fā)后氣道內壓迅速增加,在5 min內達到高峰,平均最大增幅為(119.2±30.1)%, 30 min左右逐漸恢復至正常.治療組氣道內壓平均最大增幅為(58.8±19.0)%,明顯低于哮喘組.氣道內壓最大增幅在各組之間均有顯著差異(P<0.01).2.2肺組織HE染色所見對照組支氣管、肺組織結構正常,無支氣管收縮征象,亦未見炎癥細胞浸潤.哮喘組支氣管粘膜上皮增厚,管腔明顯狹窄,可見明顯支氣管痙攣征象,管壁及其周圍大量炎細胞浸潤,除中性粒細胞及淋巴細胞外,可

15、見大量嗜酸性粒細胞.治療組支氣管粘膜上皮無明顯增厚,管腔狹窄的程度及發(fā)生頻率均較哮喘組明顯減輕,管壁及其周圍少量炎細胞浸潤,支氣管腔內無粘液栓形成.2.3AB-PAS染色所見哮喘組杯狀細胞增生明顯,從支氣管到終末細支氣管,每一級氣道均可見杯狀細胞,支氣管、葉支氣管及小支氣管杯狀細胞大量增生.隨機觀察50個終末細支氣管,38%也可見杯狀細胞,細支氣管腔內可見粘液栓形成(Fig 1A, B,C).而對照組杯狀細胞主要分布于支氣管、葉支氣管及小支氣管,細支氣管杯狀細胞很少,終末細支氣管未見杯狀細胞,支氣管腔內未見粘液栓形成(Fig1D).治療組GCH較哮喘組減輕,杯狀細胞主要分布于支氣管、葉支氣管及

16、小支氣管,少數細支氣管及終末細支氣管也可見杯狀細胞,6%的終末細支氣管也可見杯狀細胞,但杯狀細胞數目很少,細支氣管腔內未見粘液栓形成(Fig 1E, F).各組大鼠氣道杯狀細胞增生情況(各視野杯狀細胞平均數),哮喘組(105±21)和治療組(43±6),均顯著高于對照組(22±6),(P<0.01);哮喘組和治療組間差異也有顯著性(P<0.01).A: Asthmatic rats, extensive GCH develop in the epithelium of bronchia×200; B: Asthmatic rats, mucous plug in small airway×400; C:Asthmatic rats: Moderate GCH develop in the epithelium of bronchiole×400; D: Normal rats, normal epithelium bronchia with little gobletcell×400; E: Treated rats, little GCH develop in the epithelium ofbronchia×400; F: Treated